Adeede88: LAPORAN TEKNIK IDENTIVIKASI PENYAKIT WSSV PADA UDANG VANNAMEI DENGAN METODE PCR

TEKNIK IDENTIFIKASI White Spot Syndrome Virus (WSSV) PADA UDANG VANNAMEI (Litopenaus vannamei) DENGAN METODE Polymerase Chain Reaction (PCR) DI PT. SURI TANI PEMUKA

(STP) UNIT HATCHERY CARITA KECAMATAN CARITA,

KABUPATEN PANDEGLANG,

PROVINSI BANTEN

KARYA ILMIAH KERJA PRAKTEK AKHIR (KPA)

JURUSAN TEKNOLOGI BUDIDAYA PERIKANAN

TAHUN AKADEMIK 2013/2014

oleh:

DEDE HERMAWAN

NIT. 10. 3. 02. 097

KEMENTERIAN KELAUTAN DAN PERIKANAN

BADAN PENGEMBANGAN SDM KELAUTAN DAN PERIKANAN

AKADEMI PERIKANAN SIDOARJO

2014

LEMBAR PENGESAHAN

Judul : Teknik Identifikasi White Spot Syndrome Virus (WSSV) pada Udang Vannamei (Litopenaues Vannamei) dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita Kecamatan Carita, Kabupaten Pandeglang, Provinsi Banten.

Nama        :    Dede Hermawan

NIT            :    10.3.02.097

Jurusan     :    Teknologi Budidaya Perikanan

Karya Ilmiah Praktek Kerja Akhir Ini Disusun Sebagai Salah Satu

Syarat Untuk Melaksanakan Pendidikan Progrm Diploma III

Jurusan Teknologi Budidaya Perikanan

Akademi Perikanan Sidoarjo

Tahun Akademik 2013/2014

Menyetujui:

    Dosen Pembimbing I                                             Dosen Pembimbing II

Dr. Muh. Hery Riyadi A, S.Pi, M.                        Dwilaksono K, S.Pi., MT

Tanggal:                                                                 Tanggal:

Mengetahui :

Direktur

Akademi Perikanan Sidoarjo

Dr. Endang Suhaedy, A. Pi, MM, M.Si.

NIP. 19591010 198303 1 002

Telah Dipertahankan Di Hadapan Tim Penguji

Ujian Akhir Diploma III

Akademi Perikanan Sidoarjo

Dan Dinyatakan LULUS

Pada Tanggal : ………………………………..

Penyelesaian Revisi Tanggal : …………………………

Tim Penguji,

Penguji III,

HGDSJGDJSGDKAJGDJ

Penguji II,

KDLSDALKDXKSA

Penguji I,

XZLKXLZKX;ZLX

Mengetahui,

Ketua Jurusan Teknologi Budidaya Perikanan

Akademi Perikanan Sidoarjo

Dr. Muh. Hery Riyadi Alauddin, S.Pi., M.Si.

NIP. 19740304 199903 1 002

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT karena berkat rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan Proposal Kerja Praktek Akhir ini tepat pada waktunya.

Penyusunan Proposal Kerja Praktek Akhir ini dapat dilaksanakan dengan baik berkat bimbingan dan arahan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

Bapak Dr. H. Endang Suhaedy, A.Pi., MM., M.Si, selaku Direktur Akademi Perikanan Sidoarjo.

2. Bapak Dr. Muh. Hery Riyadi Alaudin, S.Pi., M.Si, selaku Ketua Jurusan Teknologi Budidaya Perikanan.

3. Bapak Dr. Muh. Hery Riyadi Alaudin, S.Pi., M.Si dan Bapak Dwilaksono K, S.Pi., MT selaku Dosen Pembimbing I dan II.

Semua pihak yang telah membantu hingga terselesaikannya proposal ini.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan proposal ini masih belum sempurna, untuk itu segala kritik dan saran demi kesempurnaan proposal ini sangat penulis harapkan.

Sidoarjo, 10 Maret 2014

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

COVER............................................................................................................. i

LEMBAR PENGESAHAN.............................................................................. ii

KATA PENGANTAR...................................................................................... iv

DAFTAR ISI .................................................................................................... v

DAFTAR TABEL............................................................................................. vi

DAFTAR GAMBAR........................................................................................ vii

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang...................................................................................... 1

1.2. Maksud dan Tujuan.............................................................................. 3

1.2.1. Maksud....................................................................................... 3

1.2.2. Tujuan......................................................................................... 3

1.3. Pendekatan Masalah............................................................................ 3

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Biologi Udang Vannamei....................................................................... 6

2.1.1. Klasifikasi Udang Vannamei....................................................... 6

2.1.2. Ciri-ciri morfologi......................................................................... 6

2.1.3. Penyebaran dan habitat.............................................................. 7

2.1.4. Kebiasaan makan....................................................................... 8

2.1.5. Sifat dan Tingkah Laku............................................................... 9

2.2. Penyakit Udang White Spot Shyndrome Virus (WSSV).......................... 10

2.2.1. Pengertian penyakit......................................................................... 10

2.2.2. Jenis Penyakit................................................................................. 10

2.2.3. Pengertian virus............................................................................... 12

2.2.4. Morfologi virus................................................................................. 14

2.2.5. Penyakit White Spot Shyndrome Virus (WSSV)............................ 15

2.2.6. Transmisi virus WSSV.................................................................... 16

2.3. Teknik Pemeriksaan Penyakit White Spot Shindrom Virus (WSSV).. 17

2.3.1. Teknik Pengambilan Sampel dan Penyimpanan Sampel......... 17

2.3.2. Teknik Fikasi Untuk Histologi......................................................... 18

2.4. Teknik Identifikasi WSSV dengan Metode PCR.................................. 18

2.4.1. Ekstraksi DNA/RNA................................................................... 19

2.4.2. Amplifikasi DNA/RNA................................................................. 20

2.4.3. Elektroforesis.............................................................................. 20

2.4.4. Running DNA............................................................................. 23

2.4.5. Pewarnaan DNA............................................................................. 23

2.4.6. Pembacaan Hasil....................................................................... 23

3. METODOLOGI

3.1. Lokasi dan Waktu KPA ........................................................................ 25

3.2. Metode KPA ......................................................................................... 25

3.3. Sumber Data ........................................................................................ 26

3.4. Teknik Pengumpulan Data .................................................................. 26

3.5. Teknik Pengolahan dan Analisis Data.................................................. 27

4. KEADAAN UMUM

4.1. Lokasi Perusahaan............................................................................... 28

4.2. Sejarah Perusahaan............................................................................. 29

4.3. Organisasi dan Ketenagakerjaan.......................................................... 30

4.4. Fasilitas Fisik......................................................................................... 30

4.4.1. Fasilitas Utama........................................................................... 30

4.4.2. Fasilitas Pendukung.................................................................... 37

5. HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Metode Penerimaan Sampel..................................................................... 38

5.2. Metode Identifikasi................................................................................ 39

5.3. Pemeriksaan Patogen Virus................................................................. 40

5.3.1. Sterilisasi Peralatan.................................................................... 40

5.3.2. Persiapan Tempat, Alat dan Bahan............................................ 42

5.3.3. Teknik Persiapan Sampel/Preparasi Sampel PCR................... 42

5.4. Ektraksi DNA........................................................................................ 43

5.4.1. Pemotongan dan Penggerusan Sampel.................................... 44

5.4.2. Degradasi Protein....................................................................... 46

5.4.3. Fase Separasi............................................................................. 47

5.4.4. Pencucian Supernatan............................................................... 49

5.4.5. Pengenceran Pelet..................................................................... 49

5.4.6. Presipitasi DNA........................................................................... 50

5.4.7. Pengenceran DNA..................................................................... 50

5.5. Amplifikasi DNA.................................................................................... 52

5.5.1. First PCR.................................................................................... 52

5.5.2. Nested PCR................................................................................ 54

5.6. Elektroforesis........................................................................................ 57

5.6.1. Pembuatan Buffer TAE (Tris Acetate EDTA)............................ 59

5.6.2. Pembuatan Ethibium Bromaide.................................................. 59

5.6.3. Pembuatan Gel Agarose............................................................ 59

5.7. Staining (Pewarnaan) DNA.................................................................. 61

5.8. Destaining (perendaman) Gel Agarose................................................ 62

5.9. Pembacaan Hasil dan Dokumentasi.................................................... 63

6.0. Penanganan Limbah Uji PCR............................................................... 64

6. KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulan........................................................................................... 66

6.2. Saran..................................................................................................... 66

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

DAFTAR TABEL

Tabel

Halaman

1. Karakteristik Patogen.................................................................................. 11

2. Perbedaan Virus dengan Sel Hidup.......................................................... 13

3. Fasilitas Wadah yang digunakan.............................................................. 36

4. Komposisi Larutan dalam Pencucian Supernatan DNA........................... 49

5. Dosis Pemberian DEPC ddH₂O sesuai dengan ukuran pellet.......... 51

6. Komposisi pembuatan MIX First PCR untuk virus WSSV.............. 52

7. Pengaturan suhu dan waktu pada proses amplifikasi I.................. 54

8. Komposisi Pembuatan MIX Second Run untuk virus WSSV........ 55

9. Pengaturan Suhu dan Waktu Amplifika II......................................... 55

10. Laporan Hasil Uji WSSV........................................................................ 64

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1.Alur Pendekatan Masalah............................................................................. 5

2.Morfologi Udang Vannamei........................................................................... 7

3.Morfologi Virus............................................................................................... 15

4.White Spot Shyndrome Virus yang Menyerang Udang Vannamei............... 16

5.Lokasi PT. Suri Tani Pemuka Carita............................................................. 29

6.Sumber Listrik................................................................................................ 31

7.Genset dan Ruang Genset............................................................................ 31

8.Pompa Air Laut dan Pump House................................................................. 32

9.Sistematis Penyediaan Air Laut..................................................................... 34

10. Proses Penyediaan Air Tawar.................................................................... 34

11. Blower......................................................................................................... 35

12. Sampel Masih dalam Kemasan Kantong Plastik...................................... 39

13. Skema Pemeriksaan Penyakit Viral dengan Metode PCR....................... 40

14. Persiapan Sterilisasi Peralatan................................................................... 41

15. Penyimpanan Alat dalam Inkubator........................................................... 42

16. Penyaringan dan Perendaman Sampel..................................................... 43

17. CTAB DTAB Solution (IQ2000 TM).......................................................... 44

18. Pemotongan Sampel.................................................................................. 44

19. Penggerusan Sampel................................................................................. 45

20. Penyimpanan Sampel Uji dalam Freezer.................................................. 46

21. Proses Inkubasi.......................................................................................... 46

22. Proses Homogenisasi................................................................................. 47

23. Proses Sentrifugasi DNA............................................................................ 48

24. Hasil Pemisahan Fase Separasi................................................................. 48

25. Pengenceran Pelet DNA............................................................................ 51

26. Pembuatan Reagent MIX First PCR.......................................................... 53

27. Proses Running I........................................................................................ 54

28. Alat Elektroforesis....................................................................................... 58

29. Pembuatan Agarose................................................................................... 60

30. Proses Pencetakan Gel Agarose............................................................... 61

31. Proses Destaining Gel Agarose.................................................................. 62

32. UV Transillumator....................................................................................... 63

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Denah Lokasi PT. STP Carita.................................................................... 66

2. Struktur Organisasi..................................................................................... 68

3. Alur Proses Masuk Air Laut........................................................................ 69

4. Hasil Uji PCR.............................................................................................. 70

5. Tanggapan Atas Permohonan KPA........................................................... 71

6. Sertifikat Hasil KPA.................................................................................... 72

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Usaha budidaya ikan laut sampai sekarang menunjukkan peningkatan yang semakin pesat. Perkembangan ini memacu kegiatan distribusi induk dan benih dari satu daerah ke daerah lain. Kegiatan ini berpotensi dalam penyebarluasan hama dan penyakit ikan baik pada usaha budidaya ataupun akibat dari distribusi ikan. Serangan wabah hama dan penyakit ikan dapat menyebabkan kematian massal atau dapat menurunkan produksi serta menurunkan kualitas produk (Balai Budidaya Laut Lampung, 2002).

Dalam budidaya udang windu dan udang vannamei munculnya penyakit merupakan kerugian besar. Berbagai fakta di lapangan memperlihatkan wabah penyakit akibat infeksi bakteri, cendawan, dan virus menyebabkan terganggunya proses budidaya karena dapat menyebabkan kematian massal.Beberapa virus yang menyerang udang di tambak adalah White Spot Syndrome Virus (WSSV) dan Taura Syndrome Virus (TSV). Nah, infeksi virus dapat dideteksi dengan cepat dan akurat dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi rantai polimerase. Teknik tersebut sebenarnya bukan barang baru, tapi pemanfaatannya dalam dunia akuakultur belum begitu lama karena tidak populer lantaran harga peralatannya relatif mahal (Bebeja, 2013).

Reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro. Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis, seorang peneliti di perusahaan CETUS Corporation. Pada awal perkembangannya metode PCR hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, namun kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul mRNA. Saat ini metode PCR telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik.

Metode PCR tersebut sangat sensitif, sehingga dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Metode ini juga sering digunakan untuk memisahkan gen-gen berkopi tunggal dari sekelompok sekuen genom. Dengan menggunakan metode PCR, dapat diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA (110 bp, 5×10⁹ mol) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit (Mullis dan Fallona, 1989). Hal ini menunjukkan bahwa pelipatgandaan suatu fragmen DNA dapat dilakukan secara cepat. Kelebihan lain metode PCR adalah bahwa reaksi ini dapat dilakukan menggunakan komponen dalam jumlah sangat sedikit, misalnya DNA cetakan (template) yang diperlukan hanya sekitar 5 µg, oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini bisa dilakukan dalam volume 50 – 100 πl (Akbar, 2013).

Oleh karena itu, mengingat pentingnya penguasaan teknik identifikasi penyakit viral pada ikan kerapu dengan metode PCR, maka penulis tertarik untuk mengambil judul Teknik Identifikasi White Spot Syndrome Virus (WSSV) pada udang vannamei dengan Metode PCR khususnya di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita. Pada Kerja Praktek Akhir ini penulis tertarik di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita karena terdapat laboratorium uji hama dan penyakit ikan yang sudah dilengkapi dengan peralatan dan perlengkapan pengujian hama dan penyakit. Selain itu, PT. Suri Tani Pemuka (STP) juga sudah terakreditasi dalam mendiagnosis beberapa penyakit viral (WSSV, IMNV, KHV, MBV maupun VNN), penyakit bakterial (Vibrio harvey, Vibrio alginolyticus), dan parasit (Zoothamnium sp, Vorticella sp, Trichodina sp).

1.2. Maksud dan Tujuan

1.2.1. Maksud

Maksud pelaksanaan Kerja Praktek Akhir (KPA) ini adalah :

1. Mengikuti kegiatan teknis identifikasi penyakit viral pada udang vannamei dengan metode PCR di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita.

2. Mengidentifikasi penyakit viral White Spot Syndrome Virus (WSSV)dengan metode PCR yang menyerang udang vannamei di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita.

3. Mengetahui prevalensi WSSV yang diperiksa dengan metode PCR di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita.

1.2.2. Tujuan

Tujuan pelaksanaan KPA ini adalah untuk meningkatkan pengetahuan dan keterampilan mengenai teknik identifikasi penyakit viral dengan metode PCR pada udang vannamei sesuai prosedur tindakan Laboratorium Hama dan Penyakit di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita.

1.3. Pendekatan Masalah

Pemeriksaan virus tidak lepas dari permasalahan-permasalahan yang dapat menimbulkan kesalahan-kesalahan baik dari segi input, proses maupun dari segi output yaitu hasil pemeriksaan sampel.

Kesalahan-kesalahan tersebut antara lain :

1. Virus merupakan mikroorganisme yang berukuran sangat kecil.

2. Sampel uji yang tidak steril sehingga mengakibatkan hasil pemeriksaan tidak sesuai.

3. Peralatan laboratorium yang kurang memadai menyebabkan kegiatan pemeriksaan menjadi terganggu.

4. Proses pemeriksaan yang kurang teliti sehingga terdapat kesalahan dalam proses identifikasi.

5. Sumber daya manusia yang rendah menimbulkan kesalahan saat pemeriksaan virus.

Adanya berbagai permasalahan yang timbul dapat menyebabkan hasil pemeriksaan virus tidak akurat meskipun telah melalui prosedur tindakan laboratorium hama dan penyakit. Hal ini mendorong adanya evaluasi beberapa faktor tersebut seperti: sampel yang diuji, peralatan laboratorium, proses identifikasi maupun sumber daya manusia yang berperan.

Jika ada perbaikan tindakan laboratorium hama dan penyakit ikan diharapkan dapat mencegah penyebaran penyakit khususnya penyakit viral dengan menerapkan tindakan laboratorium hama dan penyakit ikan yang sesuai. Alur pendekatan masalah dapat dilihat pada Gambar 1.

Rounded Rectangle: PENGAMATAN
DAN
DOKUMENTASI

Rounded Rectangle: Terinfeksi virus (+)
Dilakukan pemusnahan

Rounded Rectangle: Bebas virus (-)
Dilakukan pembebasan
Pemberlakuan sertifikat uji

Gambar 1. Alur Pendekatan Masalah

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Biologi Udang Vannamei

2.1.1. Klasifikasi Udang Vannamei

Menurut Erlangga (2012), klasifikasi udang vannamei (Litopenaeus vannamei) diklasifikasikan sebagai berikut :

Kingdom : Animalia

Subkingdom : Metazoa

Filum : Arthropoda

Subfilum : Crustacea

Class : Malacostraca

Subclass : Eumalacostraca

Superordo : Eucarida

Ordo : Decapoda

Subordo : Dendrobrachiata

Family : Penaeidae

Genus : Litopenaeus

Species : Litopenaeus vannamei

2.1.2. Ciri-ciri morfologi

Menurut Holthuis (1980) dalam Tim karya tani mandiri (2009), udang vannamei (Litopenaeus vannamei) memiliki tubuh yang dibalut kulit tipis keras dari bahan chitin berwarna putih kekuning-kuningan dengan kaki berwarna putih. Tubuh udang putih dibagi menjadi dua bagian besar, yakni bagian :

1. Cephalothorax yang terdiri atas kepala dan dada.

2. Abdomen yang terdiri atas perut dan ekor.

Cephalotorax dilindungi oleh kulit chitin tebal yang disebut juga dengan karapas (carapace). Bagian cephalotorax ini terdiri atas lima ruas kepala dan delapan ruas dada, sementara tubuhnya (abdomen) terdiri atas enam ruas dan satu ekor (telson). Bagian depan menjorok merupakan kelopak kepala yang memanjang dengan bagian pinggir bergerigi yang disebut juga dengan cucuk (rostrum). Bagian rostrum ini bergerigi dengan 9 gerigi pada bagian atas dan dua gerigi pada bagian bawah. Sementara itu, di bawah pangkal kepala terdapat sepasang mata. Udang vannamei (Litopenaeus vannamei) dengan pertumbuhan normal mempunyai laju pertumbuhan panjang 1,43 mm/hari dan pertumbuhan berat sebesar 0,28 gram/hari. Morfologi udang vannamei dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Morfologi Udang Vannamei (Litopenaeus vannamei).

Sumber : Haliman, R. W dan Adijaya (2005).

2.1.3. Penyebaran dan habitat

Erick Erlangga (2012), mengemukakan bahwa secara umum udang dapat hidup di semua jenis habitat perairan, mulai dari perairan laut, payau, hingga perairan air tawar. Sekitar 89 % udang hidup di perairan laut, 10 % hidup di perairan tawar, dan 1 % hidup diperairan teresterial. Pada umumnya habitat asli udang berada pada lingkungan perairan laut dengan salinitas yang tinggi, berkisar diatas 30 ppt. Namun, dewasa ini dengan teknik domestikasi udang dapat hidup diperairan yang memiliki salinitas yang rendah, seperti halnya dengan udang vannamei. Sejak udang didomestikasikan dari perairan laut sampai sekarang udang ini telah banyak dikembangkan dan dibudidayakan dibeberapa negara termasuk di Indonesia. Udang vannamei yang banyak dikembangkan dewasa ini merupakan udang yang termasuk ke dalam galur atau spesies Litopenaues vannamei. Udang ini berasal dari perairan di Amerika Tengah. Udang vannamei sendiri masuk ke negara kita ketika kelesuan bisnis budidaya udang melanda negara kita pada tahun 2000.

Penyebaran udang Litopenaeus vannamei meliputi pantai pasifik, Meksiko, Laut Tengah dan Amerika bagian selatan. Di tempat asalnya, Litopenaues vannamei hidup pada suhu berkisar diatas 22⁰C dan udang jenis ini sangat mudah untuk berkembang biak sehingga udang tersebut menjadi spesies andalan dalam budidaya udang dibeberapa negara, termasuk negara kita. Di beberapa negara udang ini memiliki beberapa nama diantaranya pacific white shrimp, west coast white shrimp, comaro blanco langostino white leg shrimp, camaron patiblanco dan lain sebagainya. Udang vannamei ini merupakan udang yang siklus hidupnya dimulai dari laut lepas dan bermigrasi kedaerah pantai, muara atau perairan dangkal yang kaya akan nutrien. Terkadang udang ini dapat beradaptasi pada lingkungan air yang memiliki salinitas rendah seperti disungai-sungai air tawar.

2.1.4. Kebiasaan makan

Kordi (2010), menyatakan bahwa umumnya makanan yang pertama kali dimakan oleh udang ialah plankton yang berukuran sangat kecil. Di saat menjadi larva, udang membutuhkan makanan yang harus sesuai dengan ukuran mulutnya. Bila larva udang memperoleh makanan yang sesuai dengan ukuran mulutnya , maka udang akan dapat meneruskan hidupnya. Akan tetapi, apabila dalam waktu yang relatif singkat udang tidak berhasil menemukan makanan yang cocok denganukuran mulunya akan terjadi kelaparan dan kehabisan tenaga yang menyebabkan kematian.

Seiring dengan pertumbuhannya, akan terjadi perubahan pada pola makan udang, baik dalam ukuran maupun kualitasnya. Pada waktu kecil, udang memakan plankton dan bila telah dewasa akan mengikuti kebiasaan induknya. Namun banyak biota air termasuk udang dapat menyesuaikan diri dengan persediaan makanan yang ada dilingkungannya. Dalam suatu daerah geografis yang luas untuk satu spesies udang yang hidup terpisah-pisah dapat terjadi perbedaan kebiasaan makanannya. Perbedaan ini bukan untuk satu ukuran saja tetapi untuk semua ukuran. Jadi satu spesies udang dengan ukuran yang sama dalam daerah yang berbeda dapat berbeda kebiasaan makanannya.

Di antara sifat yang terkait dengan kebiasaan makan udang adalah saling memangsa (Kanibalisme) dan ganti kulit (moulting). Pada fase Mysis sifat kanibalisme ini mulai muncul. Sifat kanibalisme ini mulai muncul disaat udang dalam kondisi lapar dan udang yang menjadi sasaran adalah udang berukuran kecil, lemah dan sedang ganti kulit. Kedua sifat ini dapat digunakan untuk memacu pertumbuhan udang budidaya. Pada proses ganti kulit aktivitas makan udang menurun dan setelah selesai ganti kulit aktivitas makannya tinggi sekali sebagai akibat tahap pemuasaan (starvasi) selama masa ganti kulit.

2.1.5. Sifat dan tingkah laku

Sifat-sifat penting udang vannamei (Litopenaeus vannamei) menurut Haliman, R. W dan Adijaya (2005), adalah sebagai berikut :

a. Aktif pada kondisi gelap (nocturnal).

b. Suka memangsa sesama jenis (kanibal).

c. Tipe pemakan lambat, tetapi terus menerus (continous feeder).

d. Menyukai hidup didasar (bentik).

e. Mencari makan lewat sensor (hemoreceptor).

f. Dapat hidup pada kisaran salinitas lebar (euryhalyne).

g. Ganti Kulit (moulting).

Udang mempunyai kerangka luar yang keras (tidak elastis). Oleh karena itu, untuk tumbuh menjadi besar udang perlu membuang kulit lama dan menggantinya dengan kulit yang baru.

2.2. Penyakit Udang White Spot Shyndrome Virus (WSSV)

2.2.1. Pengertian penyakit Udang

Penyakit adalah gangguan pada fungsi atau struktur organ atau bagian tubuh ikan. Pengetahuan tentang penyakit udang dirasakan sangat penting manakala wabah penyakit udang telah menyebabkan kegagalan dan kehilangan yang sangat bermakna.

Kegagalan budidaya perairan akibat penyakit tidak disebabkan oleh factor tunggal, akan tetapi merupakan hasil interaksi yang sangat kompleks antara udang (kualitas, stadia rawan), lingkungan, organism dan kemampuan tenaga teknis (Balai Budidaya Laut Lampung, 2002).

2.2.2. Jenis Penyakit

Penyakit didefinisikan sebagai suatu keadaan fisik, morfologi, dan atau fungsi yang mengalami perubahan dari kondisi normal karena beberapa penyebab, dan terbagi atas dua kelompok yaitu penyebab dari dalam (internal) dan luar (eksternal). Penyakit ikan umumnya adalah eksternal.

Penyakit internal : genetik, sekresi internal, imunodefisiensi, saraf dan metabolik (Yuasa dkk, 2003). Penyakit eksternal meliputi :

A) Non patogen

1. Penyakit lingkungan : suhu dan kualitas air lainnya (pH, kelarutan gas, zat beracun).

2. Penyakit nutrisi : kekurangan nutrisi, gejala keracunan bahan pakan.

B) Patogen, bersifat parasit dan terdiri atas empat kelompok yaitu :

1. Penyakit viral

2. Penyakit jamur

3. Penyakit bacterial

4. Penyakit parasit

Karakteristik setiap kelompok patogen dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Karakteristik Setiap Kelompok Patogen

Karakteristik	Virus	Bakteri	Jamur	Parasit
1	2	3	4	5
Ukuran (Penyaring 0,45 µm)	25 - 350 nm (dapat melalui penyaring)	0,6 - 30 µm (tidak dapat melalui penyaring)	Besar dari beberapa mikron (tidak dapat melalui penyaring)	Besar dari beberapa mikron (tidak dapat melalui penyaring)
Reproduksi	Transkripsi/reproduksi pada inang DNA / RNA	Segmentasi	Produksi spora	Produksi telur/spora
Kultur	Pada sel	Pada media	Pada media	Pada umumnya membutuhkan inang hidup
Deteksi	- Kultur sel, PCR - Secara imunologi - Mikroskop	- Kultur pada agar - Mikroskop - Secara imunologi	- Kultur pada agar Mikroskop	Mikroskop
Identifikasi	- Secara genetik - Secara morfologi	a. Secara biokimia b. Secara genetik	Secara morfologi	Secara morfologi

Sumber : Yuasa, dkk, (2003)

2.2.3. Pengerrtian Virus

Virus adalah parasit berukuran mikroskopik yang menginfeksi sel organisme biologis, dengan ukuran tubuh hanya berkisar antara 25 – 300 nanometer, sehingga hanya dapat dilihat dengan mikroskop elektron. Virus hanya dapat bereproduksi di dalam material hidup dengan menginvasi dan memanfaatkan sel makhluk hidup karena virus tidak memiliki perlengkapan selular untuk bereproduksi sendiri. Dalam sel inang, virus merupakan parasit obligat dan di luar inangnya menjadi tak berdaya. Biasanya virus mengandung terdiri atas protein, lipid, glikoprotein, atau kombinasi ketiganya. Genom virus menyandi baik protein yang digunakan untuk memuat bahan genetik maupun protein yang dibutuhkan dalam daur hidupnya (Agus, 2011).

Istilah virus biasanya merujuk pada partikel-partikel yang menginfeksi sel-sel eukariota (organisme multisel dan banyak jenis organisme sel tunggal), sementara istilah bakteriofag atau fag digunakan untuk jenis yang menyerang jenis-jenis sel prokariota (bakteri dan organisme lain yang tidak berinti sel). Virus sering diperdebatkan statusnya sebagai makhluk hidup karena ia tidak dapat menjalankan fungsi biologisnya secara bebas. Karena karakteristik khasnya ini virus selalu terasosiasi dengan penyakit tertentu, baik pada manusia misalnya virus influenza dan HIV, pada hewan misalnya virus flu burung atau pada tanaman misalnya virus mosaik tembakau (Diqi, 2011)

Sedangkan menurut Agus, (2011), Virus merupakan salah satu jenis mikroorganisme parasit. Virus ini mempunyai ciri-ciri tidak dimiliki oleh organisme lain. Virus hanya dapat berkembang biak di sel-sel hidup lain (sifat virus parasit obligat) karenanya, vius dapat dibiakkan pada telur ayam yang berisi embrio hidup. Untuk bereproduksi virus hanya memerlukan asam nukleat saja. Ciri lainnya, virus tidak dapat bergerak maupun melakukan aktivitas metabolisme sendiri. Selain itu irus tidak dapat membelah diri. Virus tidak dapat diendapkan dengan sentrifugasi biasa, tetapi dapat dikristalkan.

Perbedaan virus dengan sel hidup antara lain dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Beda Virus dengan Sel Hidup

No.	Pembeda	Sel hidup	Virus
1	Asam nukleat	2 tipe asam nukleat (DNA dan RNA)	1 tipe asam nukleat (RNA atau DNA)
2	Sistem metabolime	Memiliki	Tidak memiliki (harus melalui perantara inang)
3	Sistem reproduksi	Mampu memproduksi semua bagian sel	Hanya mampu memproduksi materi genetik dan selubung protein

Sumber : Alvianto, (2009)

Menurut Diqi (2011), Virus mempunyai sifat serta ciri-ciri yang berbeda dengan mikroorganisme bersel tunggal. Adapun ciri-ciri virus antara lain sebagai berikut :

a. Berukuran ultra mikroskopis.

b. Parasit sejati/parasit obligat.

c. Berbentuk oval, bulat, batang, huruf T, kumparan.

d. Kapsid tersusun dari protein yang berisi DNA saja atau RNA.

e. Dapat dikristalkan.

f. Aktivitasnya harus di sel makhluk hidup.

2.2.4. Morfologi virus

Menurut Agus (2011), Virus paling sederhana terdiri dari molekul asam nukleat tunggal yang dibungkus oleh selubung protein (kapsid). Kapsid disusun oleh kapsomer – kapsomer yang satu sama lain terikat melalui ikatan nonkovalen membentuk kesimetrisan. Untuk mengetahui struktur virus secara umum dapat dengan menggunakan bakteriofage (virus T), strukturnya terdiri dari:

a. Kepala
Kepala virus berisi DNA dan bagian luarnya diselubungi kapsid. Satu unit protein yang menyusun kapsid disebut kapsomer.

b. Kapsid
Kapsid adalah selubung yang berupa protein. Kapsid terdiri atas kapsomer. Kapsid juga dapat terdiri atas protein monomer yang yang terdiri dari rantai polipeptida. Fungsi kapsid untuk memberi bentuk virus sekaligus sebagai pelindung virus dari kondisi lingkungan yang merugikan virus.

c. Isi tubuh

Bagian isi tersusun atas asam inti, yakni DNA saja atau RNA saja. Bagian isi disebut sebagai virion. DNA atau RNA merupakan materi genetik yang berisi kode-kode pembawa sifat virus. Berdasarkan isi yang dikandungnya, virus dapat dibedakan menjadi virus DNA (virus T, virus cacar) dan virus RNA (virus influenza, HIV, H5N1). Selain itu di dalam isi virus terdapat beberapa enzim.

d. Ekor
Ekor virus merupakan alat untuk menempel pada inangnya. Ekor virus terdiri atas tubus bersumbat yang dilengkapi benang atau serabut. Virus yang menginfeksi sel eukariotik tidak mempunyai ekor.

Gambar Morfologi virus dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Morfologi Virus

Sumber: www.raritanval.com (4 Maret 2014)

2.2.5. Penyakit White Spot Shyndrom Virus (WSSV)

Sejak ditemukan pada tahun 1992 di Taiwan penyakit ini telah menjadi ancaman yang serius terhadap budidaya udang vannamei. WSSV merupakan penyakit yang disebabkan oleh virus dari golongan Nimaviridae dan memiliki bentuk basil. Virus ini memiliki Virion dengan panjang berkisar antara 210 – 380 nm dan lebar berkisar antara 70 – 167 nm. Virus ini memiliki tingkat virulensi yang tinggi dan menyebabkan kematian massal dalam jangka 2 – 33 hari setelah udang vannamei teridentifikasi terserang penyakit ini.

Udang yang terkena penyakit ini biasanya menunjukan tanda adanya bercak putih pada bagian karapas. Biasanya tanda tersebut akan terlihat jelas ketika udang telah mencapai bobot 3 – 5 gram, sedangkan dibawah itu akan sulit untuk menentukan apakah udang terserang penyakit atau tidak. Biasanya untuk udang yang bobotnya kurang dari 3 gram dilakukan tes dengan menggunakan alat shrimp test kit.

Beberapa kasus penyakit bercak putih yang terjadi pada udang vannamei umumnya akan menyerang beberapa organ vital. Organ-organ target yang sering diserang oleh virus ini diantaranya sel-sel insang, hepatopankreas dan usus. Sel-sel hepatopankreas, usus dan insang udang yang terkena penyakit ini akan mengalami kerusakan yang ditandai dengan hipertropi inti dan inklusi sel tubuh. Adanya bercak putih pada karapas dan sefalotoraks disebabkan oleh terjadinya abnormalitas pada penyimpanan garam kalsium didalam tubuh udang (Erlangga, 2012). White Spot Shyndrome Virus yang menyerang udang vannamei dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4. White Spot Shyndrom Virus yang menyerang udang vannamei

Sumber : Tigor (2014)

2.2.6. Transmisi virus WSSV

Penyebaran penyakit WSSV pada udang bisa terjadi secara vertical melalui induk menularkan ke larvanya (Kasornchandra et al., 2002) dan secara horizontal melalui air yang tidak disuci hamakan (Waterborne transmission), kotoran udang yang terinfeksi, pemamgsaan udang terinfeksi, makanan alami/segar jenis krustasea dan dari hama jenis krustasea. Untuk mengatasi dampak virus ini, diperlikan pengetahuan mengenai trasmisi infeksi virus WSSV terutama pada tingkat molekuler untuk dapat melakukan intervensi terhadap patogenisitasnya sehingga penanganan dapat dilakukan secara tuntas dan efisisn (Nurhidayah, 2010).

2.3. Teknik Pemeriksaan Penyakit White Spot Shyndrome Virus (WSSV)

2.3.1. Teknik Pengambilan dan Penyimpanan Sampel

Tahap awal yang dilakukan adalah melihat kenampakan sampel udang yang diduga terkena serangan virus, kemudian segera menyiapkan seluruh alat yang akan digunakan untuk pemeriksaan. Pemeriksaan dilakukan dengan keadaan steril agar tidak terjadi kontaminasi seperti halnya penggunaan pinset atau gunting yang berbeda pada masing-masing sampel yang akan di uji. Bahan uji diambil dari udang dengan cara menggambil bagian organ pleopode, periopode, insang dan ekor dengan menggunakan gunting dan pinset. Organ target yang telah diambil selanjutnya disimpan dalam alcohol 95 % kemudian dilakukan pemberian label atau pengkodean sampel pada masing-masing tube sesuai dengan nomor contoh. Selanjutnya disimpan sampel pada suhu 20 ⁰C dalam freezer (Pratama, 2013).

Sedangkan menurut Faruza (2014), teknik pengambilan sampel dan seberapa banyak individu yang akan diambil sangat dipengaruhi oleh tujuan pemeriksaan dan kegiatan yang dilakukan, untuk tujuan monitoring rutin dan tidak menunjukan tanda serangan maka sampling dilakukan secara random dengan jumlah sampel yang diambil antara 5 – 10 ekor untuk ukuran besar, sedangkan benih antara 10 – 15 ekor. Sedangkan apabila dalam populasi menunjukan tanda ada serangan maka dapat diambil yang menunjukan tanda seperti :

· Berenang kepermukaan

· Berenang terbalik kemudian mati

· Menunjukan gajala abnormal lainnya.

2.3.2. Teknik Fikasi Untuk Histologi

Maksud fikasi adalah :

· Untuk mematikan dan mengeraskan jaringan secara cepat dan aman.

· Memelihara sel atau jaringan terhadap perubahan autolysis dan pembusukan.

· Menjaga sel atau jaringan agar lebih tahan terhadap proses dehidrasi, clearing, embedding dan staining.

Larutan fikasi harus cukup untuk memfikasi atau mengawetkan sampel secara sempurna, oleh karena itu untuk masing-masing specimen dengan volume 10 ml diperlukan larutan fikasi 100 ml (10 kali lipat volume sampel). Untuk sampel crustacean sebaiknya digunakan larutan Davidson sebagai fikasi sedangkan untuk sanpel ikan pada umumnya digunakan 10 % buffer formalin (Faruza, 2014)

2.4. Teknik Identifikasi WSSV dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA.

Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106 – 107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µg, oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100 µl. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuens DNA dalam genom bakteri. Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerase (Yudha, 2012).

Prinsip kerja uji PCR adalah mengekstraksi DNA/RNA dari sampel. Berikutnya memperbanyak potongan-potongan DNA/RNA yang membawa informasi genetika tertentu, dan sebagai langkah terakhir adalah proses elektroforesis untuk melihat hasil produk PCR. Sampel yang diuji PCR sebaiknya dalam kondisi segar. Namun bila tidak memungkinkan sampel dapat disimpan dalam larutan alkohol 95 % (perbandingan 1: 9, 1 bagian sampel dengan 9 bagian alkohol 95 %) untuk kemudian dikirim ke laboratorium (Bebeja, 2013).

2.4.1. Ekstraksi DNA/RNA

Menurut Babaja (2013), proses tersebut dilakukan dengan memakai larutan Lysis Buffer (IQ2000 TM). DNA diekstrak dari sel-sel sampel untuk kemudian diamankan dari kerusakan akibat kerja enzim dNase. Selanjutnya ekstrak disentrifus sehingga diperoleh butiran/pelet DNA, yang akan dipakai dalam tahap kedua proses uji PCR. Untuk mengekstrak RNA digunakan RNA Extraction Solution (IQ2000 TM), yang sekaligus akan mengamankan RNA dari kerusakan akibat kerja enzim rNase.

Hasil ekstraksi DNA/RNA pada tahap pertama tersebut lantas digandakan dengan bantuan enzim-enzim yang dikenal sebagai primer. Satu jenis primer bertanggung jawab atas penggandaan satu jenis DNA/RNA tertentu, sehingga primer WSSV hanya bisa dipakai untuk uji WSSV. Demikian seterusnya. Proses penggandaan DNA/RNA dengan bantuan enzim-enzim ini dikenal sebagai proses amplifikasi yang dilakukan pada kondisi suhu dan siklus penggandaan tertentu, yang dapat diatur pada thermocycle. Alat itu disebut sebagai mesin PCR.

2.4.2. Amplifikasi DNA/RNA

Menurut Hardian (2009), amplifikasi merupakan proses dimana dilakukannya perpanjangan DNA menggunakan Primer yang memerlukan Taq DNA polymerase yang termostabil, biasanya pada suhu 72 °C, yang merupakan suhu optimal untuk aktivitas enzim polymerase. Lamanya masa inkubasi tiap temperatur, perubahan suhu dan jumlah siklus dikontrol secara terprogram menggunakan programmable thermal cycler. Analaisa produk PCR tergantung pada kebutuhann PCR. Jika menggunakan PCR konvensional, maka produk PCR dapat dideteksi dengan agarose gel electrophoresis dan ethidium bromide (atau dye nukleotida lainnya).

2.4.3. Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397).

Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (Brown 1992: 19).

Sedangkan menurut Prasetyo (2009), elektroforesis adalah perpindahan molekul yang bermuatan sebagai respon terhadap medan listrik. Angka perpindahan tergantung pada kekuatan medan listrik, muatan listrik, ukuran dan bentuk molekul, kekuatan ionik, viskositas, dan suhu medium yang digunakan oleh molekul tersebut untuk berpindah. Ada bermacam-macam zat kimia yang digunakan sebagai gel di dalam proses elektroforesis. Penggunaan jenis gel disesuaikan dengan tujuan yang akan dicapai. Pada umumnya ada dua cara yang digunakan dalam proses elektroforesis yaitu elektroforesis gel agarose (AGE) dengan visualisasi menggunakan ethidium bromide dan elektroforesis gel polyacrilamide (PAGE) dengan visualisasi menggunakan silver staining (Sulandari, Sri, M. Syamsul, 2003).

Sebelum melakukan proses elektroforesis pertama-tama disiapkan terlebih dahulu larutan ethidium bromide dan agarose yang mana langkah-langkahnya seperti berikut:

1) Persiapan Et Br (Ethidium Bromide)

Ethidium bromide adalah zat mutagen yang sangat kuat dan dapat menyebabkan kanker. Oleh karena itu dalam menggunakan zat ini harus dilengkapi dengan sapu tangan dan masker sebagai pelindung diri. Etidium merupakan sebuah molekul yang dapat mengikat kuat pada DNA. Etidium juga biasa digunakan dalam biokimia untuk memvisualisasi potong-potongan DNA yang telah dipisahkan pada gel elektroforesis. Ethidium bromide disiapkan dalam larutan stock 10 mg/ml dalam botol gelap.

2) Persiapan Agarose

Agarose adalah polimer linier yang tersusun dari residu D-galaktose dan L-galaktose. Agarose yang dibuat sebesar 1,5-2% dalam larutan 1 TAE atau 1 TBE dalam botol gelas kemudian panaskan pada suhu 100 – 150 ⁰C selama 10 menit dalam microwave hingga bening. Setelah dipanaskan kemudian didinginkan hingga suhunya mencapai 60 ⁰C. Agarose yang cukup dingin dituangkan ke dalam cetakan agarose yang telah dipasangi sisir dan yang perlu diperhatikan saat penuangan yakni menghindari terjadinya gelembung udara namun jika ada gelembung udaranya dapat dibuang dengan menggunakan mikrotip.

Setelah agarose telah terbentuk dan siap digunakan maka berlanjut pada proses elektroforesis dimana 2 µl loading dye disiapkan sesuai jumlah sampel yang ada. Kemudian lakukan preparasi DNA marker, masukan 4 µl marker dalam sumur gel agarose. Amplicon hasil PCR sebanyak 10 µl dicampurkan dengan masing-masing loading dye dan masukan 10 µl campuran tersebut dalam sumur berikutnya. Setelah semua dimasukan dalam gel agarose kemudian alirkan listrik 100 V hingga indikator warna bromphenol blue bergerak ¾ bagian dari panjang gel.

2.4.4. Running DNA

Running DNA berlangsung didalam gel yang direndam pada larutan buffer. Running DNA ini dibantu dengan adanya aliran listrik pada alat elektroforesis. Dimana DNA di dalam gel mengikuti arus listrik dari kutub negatife menuju kutub positif. Pergerakan ini terjadi dimana fragmen DNA yang lebih kecil berat molekulnya akan berjalan lebih cepat dari molekul DNA yang lebih besar. Setelah menunggu ± 1 jam baru kemudian gel agarose diangkat dan siap menuju tahap selanjutnya.

2.4.5. Pewarnaan DNA

Pewarnaan DNA dengan larutan Et Br ini akan memudahkan kita untuk dapat melihat hasilnya karena biasanya dalam proses ini Et Br dapat memvisualisasikan potongan DNA setelah melalui proses elektroforesis. Pewarnaan dimulai dengan memasukan 0,05 % Et Br dalam wadah plastic bersamaan dengan gel agarose hingga terendam seluruhnya. Digoyang-goyangkan selama 10 menit agar larutan terserap pada gel agarose kemudian diangkat. Untuk menghilangkan Et Br yang tersisa gel agarose direndam kembali dalam aquades selama 10 menit dengan perlakuan yang sama dengan Et Br di atas. Kemudian letakan gel agarose pada UV transilluminator untuk dibaca hasilnya.

2.4.6. Pembacaan Hasil

Menurut OIE (2003), Pembacaan hasil adalah pembacaan hasil elektroforesis yang dibaca dengan bantuan sinar UV serta pendaran warna dari Ethibium Bromide dan pengamatan yang sudah ditambahkan pada Agarose.

Pemberian Ethibium Bromide adalah untuk mendeteksi asam nukleat bentuk tunggal atau ganda (baik DNA atau RNA). Dalam Ethibium Bromide terdapat substansi yang mengandung gugus planar. Posisi yang tetap gugus ini dan letaknya berdekatan dengan basa-basa menyebabkan zat warna yang terikat pada DNA menunjukkan peningkatan fluorisensi dibanding zat warna yang bebas dalam larutan (Haryana dan Prakoso, 1989). UV transilluminator adalah alat yang digunakan untuk memaparkan gambaran pita DNA yang telah diwarnai dengan Ethidium Bromide dalam media gel agarose. Pita DNA yang terbentuk dengan menggunakan UV transilluminator dilakukan dengan membandingkan pergerakan pita pada sampel dengan kontrol positif dan negatif. Semakin terang pada UV transilluminator, maka infeksi virus tersebut semakin positif.

3. METODOLOGI

3.1. Lokasi dan Waktu KPA

Kerja Praktek Akhir (KPA) ini akan dilaksanakan selama 1,5 bulan dari tanggal 24 Maret – 09 Mei 2014 di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita Kecamatan Carita Kabupaten Pandeglang Provinsi Banten. Jadwal rencana kegiatan Kerja Praktek Lapang (KPA) dapat dilihat pada Lampiran 1.

3.2. Metode KPA

Metode yang digunakan dalam pelaksanaan KPA ini adalah metode survey dengan sistem magang. Metode survey adalah penyelidikan untuk memperoleh fakta dari gejala yang ada dan mencari keterangan secara faktual (Nazir 1999).

Sedangkan untuk memperoleh pengetahuan dan keterampilan dilakukan dengan partisipasi langsung dalam proses identifikasi penyakit viral pada udang vannamei. Penulis juga mengikuti secara menyeluruh proses kegiatan pemeriksaan virus dengan pola magang. Hal yang akan diamati adalah tindakan laboratorium hama dan penyakit ikan di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Carita yaitu mengenai kegiatan identifikasi penyakit udang golongan virus, meliputi perlakuan udang yang terserang virus, pemusnahan uadang yang terserang virus, dan lain-lain. Lebih jelasnya Setiadjit (2008), menegaskan sistem magang adalah suatu belajar mengajar dalam bentuk praktek secara langsung di tempat yang digunakan untuk magang yang bertujuan untuk meningkatkan keterampilan, kompetensi dan kecakapan dalam membuat kreativitas, sikap kritis, rasa percaya diri dan jiwa kewiraswastaan. Survey ini dilakukan dengan mencari data dan mencatat hal-hal penting mengenai proses identifikasi sambil ikut berpatisipasi langsung dilapangan.

3.3. Sumber Data

Berdasarkan sumber data yang diperoleh, terdiri dari data primer dan data sekunder. Menurut Subagyo (1991), pengertian data primer dan data sekunder adalah :

a. Data primer adalah data yang diperoleh secara langsung dari sumber di tempat KPA, yang diperoleh secara langsung melalui wawancara, observasi serta partisipasi di lapangan. Termasuk data primer adalah alat dan bahan PCR serta prosedur kerja alat-alat PCR.

b. Data sekunder adalah data atau informasi yang diperoleh secara tidak langsung dari sumbernya. Dapat berupa literatur di perpustakaan atau internet dalam bentuk dokumen yang nantinya digunakan untuk melengkapi laporan tentang teknik identifikasi penyakit viral WSSV pada udang vannamei. Termasuk data sekunder adalah letak, struktur organisasi, sarana dan prasarana di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita.

3.4. Teknik Pengumpulan Data

Teknik pengumpulan data dilaksanakan dengan cara :

a Observasi partisipan, menurut Narbuko dan Achmadi (2004), yang dimaksud dengan observasi partisipan yaitu apabila orang yang melakukan observasi turut ambil bagian atau berada dalam keadaan obyek yang diobservasi. Observasi meliputi berbagai hal yang dilakukan mulai dari pengambilan sampel ikan sampai identifikasi ikan yang akan diteliti.

b.Interview atau wawancara adalah proses memperoleh keterangan untuk tujuan penelitian dengan cara tanya jawab sambil bertatap muka antara sipenanya atau pewawancara dengan sipenjawab atau responden dengan menggunakan alat yang dinamakan interview guide (panduan wawancara) atau juga dengan menggunakan daftar kuisioner. Daftar kuisioner dapat dilihat pada Lampiran 2.

3.5. Teknik Pengolahan dan Analisa Data

Menurut Narbuko dan Achmadi (2004), setelah data primer dan data sekunder terkumpul kemudian data tersebut diolah dengan cara:

a. Editing : kegiatan mengecek, memeriksa dan mengoreksi data yang telah terkumpul.

b. Tabulating : menyusun data ke dalam bentuk tabel agar mudah dimengerti.

Analisis data yang digunakan adalah analisis deskriptif. Penggunaan analisis deskriptif bertujuan agar data dapat disajikan sesuai dengan keadaan yang sebenarnya tanpa memberikan perlakuan apapun, sehingga dapat dengan mudah mengambil kesimpulan.

IV. KEADAAN UMUM

4.1. Lokasi Perusahaan

PT. Suri Tani Pemuka (PT. STP) Carita Banten merupakan Unit pelaksana proses produksi naupli dan benur udang vannamei (Litopenaeus vannamei) yang terletak di Desa Banjarmasin, Kecamatan Carita, Kabupaten Pandeglang, Propinsi Banten. PT. STP Carita berada 6 km di sebelah selatan kota Labuan dan 1 km di sebelah utara pantai pariwisata Carita. Berikut adalah batas lokasi PT. STP Carita :

Sebelah Timur : Jalan Raya Labuan – Crita.

Sebelah Barat : Selat Sunda

Sebelah Utara : Kecamatan Labuan

Sebelah Selatan : Pantai pariwisata Carita Banten.

Secara geografis, PT. Suri Tani Pemuka Carita terletak di tepi pantai Selat Sunda, dengan ketinggian tempat (Topografi) ± 2 m di atas permukaan laut. Secara geografis PT. Tani Suri Pemuka Carita terletak pada posisi koordinat 6º 21’ hingga 7º 10’ LS dan 104º 48’ hingga 106º 11’ LT. Salinitas air laut pada perairan Selat Sunda berkisar antara 30 – 33 ppt. Selat Sunda yang merupakan sumber air media pemeliharaan memiliki dasar perairan yang berpasir dan berkarang, dimana hal tersebut merupakan salah satu persyaratan lokasi yang baik dalam melakukan proses produksi benur udang vannamei.

PT. STP Carita memiliki areal seluas 2.001 m² dengan luas bangunan 1.000 m² yang digunakan sebagai fasilitas utama dan fasilitas pendukung kegiatan pemeliharaan larva udang vannamei. Letak bangunan di PT. STP Carita diatur berdasarkan keterkaitan fungsional, artinya bangunan-bangunan yang berkaitan dengan usaha pemeliharaan larva, seperti tempat penampungan air (Tandon), tempat pemeliharaan larva, laboratorium, dan tempat kultur pakan alami dibangun secara berdekatan. Hal ini bertujuan agar proses pemeliharaan larva udang vannamei dapat berjalan lancar serta dapat menekan biaya investasi yang dikeluarkan. Lokasi PT. Suri Tani Pemuka Carita berdasarkan foto udara dapat dilihat pada Gambar 5.

Lokasi

Gambar 5. Lokasi PT. Suri Tani Pemuka Carita

Sumber : Data Primer (2014)

4.2. Sejarah Perusahaan

PT. Suri Tani Pemuka (STP) Carita merupakan unit pelaksana proses produksi naupli dan benur udang vannamei (Litopenaeus Vannameii) yang bernaung dan bertanggung jawab dibawah PT. Suri Tani Pemuka Pusat. PT. STP Carita secara resmi berdiri pada tanggal 01 Mei 2008. Bangunan dan lahan yang sekarang digunakan oleh PT. STP Carita sebagai tempat produksi benur udang vannamei merupakan milik Dinas Kelautan dan Perikanan pemerintah Kabupaten Pandeglang yang sebelumnya juga pernah dikontrak oleh UD. Shrimp Club Hatchery Lampung pada tahun 2007 – 2008. Kemudian pada tanggal 01 Mei 2008, PT. Suri Tani Pemuka Carita mengambil alih kontrak karena UD. Shrimp Club Hatchery Lampung mengalami krisis dan kegagalan dalam produksi.

4.3. Organisasi dan Ketenagakerjaan

PT. Suri Tani Pemuka Carita merupakan anak perusahaan dari Japfa Group. Perusahaan ini dipimpin oleh seorang kepala operasional yang membawahi tujuh bagian, yaitu bagian produksi, bagian gudang, bagian Quality Control (QC), bagian pembelian (Purchasing), bagian personalia (PGA), bagian accounting, bagian induk dan bagian pemasaran. Pada masing-masing bagian tersebut dikoordinir oleh karyawan yang telah diberi tanggungjawab terhadap pelaksanaan kegiatan sesuai dengan bagiannya. PT. STP Carita menerapkan prinsip koordinasi, integrasi, dan sinkronisasi di lingkungan perusahaan sesuai dengan tugas masing-masing.

PT. STP Carita memiliki karyawan sebanyak 32 orang, terdiri dari bagian pelaksana produksi yang berjumlah 25 orang, 7 orang bertugas pada bagian umum, dan bagian pemasaran berjumlah 5 orang. Tingkat pendidikan karyawan di PT. STP Carita yaitu tingkat SLTP, SLTA, D3 dan S1. Struktur organisasi PT. STP Carita dapat dilihat pada Lampiran 2.

4.4. Fasilitas Fisik

4.4.1. Fasilitas Utama

Dalam rangkaian kegiatan pemeliharaan larva udang vannamei (Litopenaeus vannamei) tidak terlepas dari fasilitas fisik yang memadai dalam menunjang kelancaran proses produksi. Fasilitas fisik tersebut terbagi menjadi dua yaitu fasilitas utama dan fasilitas pendukung. Pada PT. Suri Tani Pemuka Carita memiliki fasilitas utama untuk menunjang jalannya kegiatan pemeliharaan udang vannamei. Fasilitas ini merupakan bagian utama untuk menjalankan proses produksi, yang meliputi :

1. Sumber Listrik

Energi listrik yang terdapat di PT. STP Carita berasal dari pasokan Perusahaan Listrik Negara (PLN) yang memiliki daya total sebesar 1000 Watt. Untuk mengatasi apabila terjadi permasalahan yang dapat mengganggu jalannya proses produksi seperti pemadaman listrik atau yang lainnya, PT. STP Carita menggunakan pengganti sumber energi listrik yaitu dua buah genset yang memiliki kapasitas total 750 watt. Genset milik PT. STP Carita ditempatkan dalam ruang genset. Untuk mengetahui lebih jelas mengenai sumber listrik yang digunakan di PT. STP Carita dapat dilihat pada Gambar 6 dan 7.

Gambar 6. Sumber Listrik

Sumber : Data Primer

Gambar 7. Genset dan Ruang Genset

Sumber : Data Primer

2. Sistem Pengairan

a. Penyediaan Air Laut

Di PT. STP Carita, proses penyediaan air laut dilakukan dengan cara memompa air laut yang bersumber dari Selat Sunda yang kemudian melewati beberapa perlakuan seperti pengendapan, penyaringan dan treatmen air sebelum masuk ke dalam bak larva sebagai media pemeliharaan larva udang vannamei. Proses pengambilan air laut dibantu menggunakan dua pompa bermesin diesel dengan merk EBARA dan NS-100 yang masing-masing memiliki daya sebesar 15 KVA dan 10 KVA. Pompa tersebut ditempatkan dalam ruangan yang biasa disebut pump house. Suplai air laut dilakukan pada saat terjadi pasang air laut ataupun surut air laut yaitu pada siang maupun malam hari. Air laut yang digunakan mempunyai salinitas 30 – 33 ppt. Pompa air laut dan pump house yang terdapat di PT. STP Carita dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8. Pompa Air Laut dan Pump House

Sumber : Data Primer

Dalam pendistribusiannya, air laut disalurkan melalui pipa PVC berukuran 4 inchi yang dirangkai memanjang hingga mencapai jarak 100 meter. Air laut hasil penyedotan kemudian dialirkan ke dalam bak sedimentasi yang berukuran 3 x 2 x 2 meter³ yang bervolume 12 ton dan berjumlah 2 buah. Bak sedimentasi bertujuan untuk mengendapkan partikel-partikel kasar yang terdapat dalam air laut. Dari bak sedimentasi kemudian dialirkan kembali ke dalam bak penyaringan (Sand Filter) yang menggunakan pasir pantai berukuran 19 x 3 x 2 meter³. Setelah dilakukan proses filterisasi, kemudian air laut dialirkan ke dalam bak penampungan air laut (tandon air laut) yang berukuran 9 x 9 x 4 meter³ dengan kapasitas total air laut sebanyak 324 ton. Bak penampungan yang terdapat di PT. STP Carita sebanyak dua buah dan ditempatkan pada ruangan tertutup agar tidak terjadi kontaminasi dari luar.

Pada bak tandon diisi air laut sebanyak 220,5 ton dan air tawar sebanyak 29,5 ton. Pengenceran air tersebut dilakukan agar salinitas air yang nantinya akan digunakan sebagai media pemeliharaan dapat mencapai salinitas 30 ppt. Hal ini dilakukan agar air media dapat disesuaikan dengan media hidup aslinya di alam. Setelah tertampung dalam bak tandon, dilakukan treatmen terhadap air untuk membunuh mikroorganisme yang berpotensi menjadi bibit penyakit.

Treamen air dilakukan dengan cara memberikan larutan kaporit yang telah diendapkan sebanyak 25 ppm selama 8 jam. Untuk menetralkan air terhadap kaporit diberikan natrium thiosulfat sebanyak 5 ppm dan didiamkan selama 4 jam. Setelah mencapai waktu yang telah ditentukan, dilakukan pengujian untuk mengetahui tingkat kenetralan air terhadap kaporit menggunakan Chlorin test. Pengujian tersebut dilakukan dengan cara mengambil sampel air sebanyak 5 ml kemudian diberi 4 – 5 tetes oto 1 test. Apabila warna air berubah menjadi kekuning-kuningan hal tersebut menandakan bahwa dalam air masih terkandung kaporit, begitu pula sebaliknya. Mengenai proses penyediaan air laut di PT. STP Banyuwangi secara sistematis dapat dilihat pada Gambar 9.

Gambar 9 : Sistematis penyediaan air laut

Sumber : Data Primer

b. Penyediaan Air Tawar

Air tawar yang digunakan di PT. STP Carita bersumber dari sumur bor yang diambil menggunakan bantuan pompa air merk NS-80 dari kedalaman 60 meter. Kemudian air didistribusikan ke dalam bak penampungan air tawar melalui pipa berukuran 3 inchi. Bak penampungan air tawar yang terdapat di PT. STP Carita berjumlah dua buah yang berbentuk tabung berukuran 7,7 x 4 (luas alas x tinggi) dengan kapasitas total yaitu 28 ton. Air tawar yang tertampung didistribusikan menggunakan sistem gravitasi, hal tersebut dilakukan karena bak penampungan ditempatkan pada ketinggian 5 meter di atas permukaan tanah. Proses penyediaan air tawar dapat dilihat pada Gambar 10.

Gambar 10. Proses Penyediaan Air Tawar

Sumber : Data Primer

3. Sistem Aerasi

Dalam pengoperasiannya, PT. STP Carita menggunakan blower sebagai sumber oksigen terlarut dalam bak pemeliharaan larva udang vannamei. Blower tersebut berjumlah tiga buah dan ditempatkan pada ruangan blower. Dalam penggunaannya, blower disesuaikan dengan kebutuhan produksi pada saat itu. Proses pengaliran udara dari blower ke area produksi menggunakan instalasi pipa yang berdiameter 4 inchi. Sedangkan untuk pipa aerasi sekunder dan tersier yang berada di sepanjang ruang produksi memiliki diameter 1 - 2 inchi yang terhubung langsung dengan selang aerasi, batu aerasi dan timah pemberat ke tiap-tiap bak. Blower yang digunakan di PT.Suri Tani Pemuka dapat dilihat pada Gambar 11.

Gambar 11. Blower

Sumber : Data Primer (2014)

4. Wadah dan Tata Letak

Suatu perusahaan pembenihan udang vannamei dalam menjalankan usahanya memerlukan fasilitas wadah yang mempunyai fungsi masing-masing. Apabila salah satu dari wadah tidak tersedia, maka jalannya proses produksi akan terganggu. Fasilitas wadah yang digunakan di PT. STP Carita dalam menjalankan kegiatan produksi benur larva udang vannamei dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Fasilitas wadah yang digunakan di PT. STP Carita

No	Jenis Wadah	Ukuran	Jumlah
1	2	3	4
1	Bak Maturasi	15 x 10,5 x 1,5 m³	4 Buah
2	Bak Pemijahan	15 x 10,5 x 1,5 m³	8 Buah
3	Bak Penetasan	2 Ton	2 Buah
4	Holding Tank	500 Liter	5 Buah
5	Bak Kultur Alga (Skala Intermediet)	1 ton	21 Buah
6	Bak Kultur Alga (skala Massal)	4 x 2 x 1,5 m³	19 Buah
7	Bak Kultur Artemia	500 Liter	11 Buah
8	Bak Sedimentasi	3 x 2 x 2 m³	2 Buah
9	Bak Sand Filter	20 x 3 x 2 m³	1 Buah
10	Bak Penampungan Air Laut	9 x 9 x 4 m³	2 Buah
11	Bak Penampungan Air Tawar	28 Ton	2 Buah
12	Bak Pemeliharaan Larva	7 x 3 x 1,5 m³	20 Buah

Sumber : Data Primer, (2014).

Tata tetak bangunan di PT. STP Carita diatur berdasarkan keterkaitan fungsional, artinya bangunan-bangunan yang berkaitan dengan usaha pemeliharaan larva udang vannamei, seperti tempat penampungan air, tempat pemeliharaan larva, laboratorium dan tempat kultur pakan alami dibangun secara berdekatan. Hal ini bertujuan agar proses pemeliharaan larva dapat berjalan lancar serta dapat menekan biaya investasi yang dikeluarkan. Lay out tata letak bangunan PT. STP Carita dapat dilihat pada Lampiran 1.

4.4.2. Fasilitas Pendukung

Pada PT. Suri Tani Pemuka (PT. STP) Carita selain terdapat fasilitas utama, juga terdapat fasilitas pendukung kegiatan pemeliharaan larva udang vannamei. Apabila salah satu dari fasilitas pendukung tidak tersedia, kegiatan produksi akan terhambat.

Fasilitas pendukung yang dimiliki PT. STP Carita berupa bangunan-bangunan kerja yang meliputi mess pegawai dan tamu, pos jaga keamanan perusahaan, mushola, rumah pompa, rumah genset, kantor, gudang penyimpanan pakan, gudang teknik, kantin, laboratorium dan peralatan pendukung kegiatan produksi.

5. HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Metode Penerimaan Sampel PCR

Di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita hanya menerima sampel atau melayani pemeriksaan penyakit viral dari perusahaan yang masih satu management seperti PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Anyer, PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Indramanyu dan dari Unit Hatchery Caritanya sendiri. Pemeriksaan penyakit viral atau uji PCR di PT. STP Unit Hatchery Carita dilakukan pada saat 2 – 3 hari sebelum panen larva dan disekaliguskan dengan pemeriksaan penyakit viral atau uji PCR pada telur udang, naupli, bagian organ pada induk, pakan induk dan lingkungan. Dalam metode penerimaan sampel ini bertujuan agar tidak terjadi kesalahan ataupun tertukarnya alamat sampel satu dengan sampel yang lain, sehingga mempermudah dalam pengkodean sampel dan preparasi sampel.

Sampel yang datang dari PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Anyer ataupun PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Indramanyu sudah terdapat kode dan alamat masing-masing yang masih dalam kemasan kantong plastik, sampel tersebut diterima oleh kepala bagian laboratorium PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatchery Carita dan selanjutnya akan dilakukan pemeriksaan oleh petugas laboratorium uji penyakit viral. Sampel ini dapat langsung ditangani dan dilakukan preparasi atau disimpan terlebih dahulu pada freezer agar tidak terjadi pembusukan terhadap sampel. Hal ini sesuai dengan pendapat Pratama (2013), yang menyatakan bahwa setelah dilakukan pemberian label atau pengkodean sampel pada masing-masing sesuai dengan nomor contoh. Selanjutnya disimpan sampel pada suhu 20 ⁰C dalam freezer. Sampel masih dalam kemasan kantong plastik yang baru tiba dapat dilihat pada Gambar 12.

Gambar 12. Sampel masih dalam kemasan kantong plastik.

Sumber : Data Primer (2014)

5.2. Metode Identifikasi

Tindakan pemeriksaan virus udang vannamei yang dilakukan di Laboratorium Pengujian Mutu PT. Suri Tani Pemuka (STP) Unit Hatcehry Carita meliputi: pengamatan gejala klinis dan identifikasi virus dengan metode PCR. Pengamatan gejala klinis dilakukan sebelum uji lanjut laboratoris terhadap suatu kasus penyakit ikan.

Pengamatan didasarkan pada kondisi tubuh ikan dan gejala klinis dari udang vannamei yang terinfeksi WSSV . Adapun infeksi awal organ yang terkena adalah lambung, insang, kutikula epidermis dan jaringan ikat hepatopankreas seterusnya stadium lanjut terjadi pelepasan partikel virus dan lesi homolimfe meyebabkan viremia, infeksi berat terjadi pada organ limfoid, glandula antenna, jaringan otot, jaringan hematopictik, jantung, lambung dan saluran pencernaan belakang. gejala klinis udang vannamei yang terinfeksi WSSV adalah adanya bercak putih pada bagian karapas, larva lemah dan napsu makan turun.

Gejala klinis udang yang terserang WSSV ini, kemudian dilakukan pemeriksaan lebih lanjut dengan metode PCR. Adapun tindakan pemeriksaan dengan metode PCR secara keseluruhan meliputi: ekstraksi RNA, amplifikasi RNA, elektroforesis, pembacaan hasil dan dokumentasi. Skema pemeriksaan penyakit viral WSSV yang menyerangudang vannamei dengan metode PCR dapat dilihat pada Gambar 13.

Gambar 13. Skema Pemeriksaan Penyakit Viral dengan Metode PCR

Sumber : Data Primer (2014)

5.3. Pemeriksaan Patogen Virus

5.3.1. Sterilisasi Peralatan

Sterilisasi peralatan sangatlah penting dalam melakukan proses pengujian terutama untuk pemeriksaan identifikasi penyakit virus. Sterilisasi ini bertujuan untuk mensuci-hamakan peralatan yang akan digunakan. Alat yang digunakan untuk sterilisasi adalah : autoclave. Alat-alat yang disterilisasi dalam autoclave meliputi: tabung eppendorf 1,5 ml dan 0,5 ml, mikrotip 0,2 ml, 0,5 ml dan 1,5 ml, serta pastle. Untuk tabung eppendorf 1,5 ml dan 0,5 ml dibungkus terlebih dahulu dengan koran sebelum dimasukkan ke autoclave. Sedangkan untuk mikrotip 0,2 ml, 0,5 ml dan 1,5 ml diatur dalam tempat mikrotip lalu dibungkus dengan koran sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Hal ini dilakukan agar sterilisasi alat dapat dilakukan secara maksimal. Persiapan sterilisasi peralatan dapat dilihat pada Gambar 14.

Gambar 14. Persiapan Sterilisasi Peralatan

Sumber : Data Primer (2014)

Sterilisasi peralatan dengan autoclave menggunakan suhu 121 ºC selama 15 menit dan tekanan 1 atm, sehingga pada suhu yang sangat tinggi ini mikroorganisme yang terdapat dalam peralatan yang disterilisasi akan mati. Sebelum menggunakan autoclave, perlu dicek terlebih dahulu mengenai kondisi heater di dalam autoclave harus terendam aquades. Setelah proses sterilisasi selesai, autoclave didiamkan hingga tekanannya menjadi 0 atm.

Peralatan yang telah disterilkan, dikeluarkan dan dikeringkan dalam inkubator dengan pengaturan suhu 80 ⁰C selama 1 jam. Hal ini dilakukan agar uap air yang terdapat di dalam peralatan cepat kering serta menghindari kontaminasi terhadap peralatan yang lain. Kemudian peralatan tersebut disimpan dalam lemari. Proses penyimpanan di inkubator dapat dilihat pada Gambar 15.

Gambar 15. Penyimpanan Alat dalam Inkubator

Sumber : Data Primer (2014)

5.3.2. Persiapan tempat, alat dan bahan

Rak tabung yang akan digunakan dicuci bersih dengan sabun cair dan dikeringkan. Sedangkan untuk Pipetor dan meja yang digunakan untuk PCR dibersihkan dengan kertas tissue dan menyemprotkan alkohol 70%. Hal ini sesuai dengan pendapat Sulandari (2003), yang menyatakan bahwa pipetor yang akan digunakan dibersihkan dengan menggunakan kertas tissue. Meja tempat bekerja (fume hood/laminar flow) dibersihkan dengan ethanol 70% sehingga bebas dari debu dan bakteri. Kemudian untuk semua bahan ekstraksi (CTAB dan DTAB Solution) disimpan dalam suhu 2 – 8 ⁰C sedangkan untuk bahan amplifikasi PCR disimpan pada suhu -20 ºC.

5.3.3. Teknik persiapan sampel/preparasi sampel PCR

Sampel yang digunakan di Laboratorium Pengujian penyakit viral PT.STP Carita diperoleh dari daerah Unit Hatchery Indramayu, Anyer dan dari Caritanya sendiri. Pengambilan dan pengawetan sampel sangat berpengaruh dalam pemeriksaan PCR. Sehingga sebelum melakukan pemeriksaan PCR harus mengetahui organ target yang akan diekstraksi. Karena tidak semua bagian tubuh udang khususnya induk dapat digunakan sebagai sampel untuk diperiksa menggunakan PCR, untuk induk udang biasanya organ yang diambil adalah insang, ekor dan kaki. Hal ini sesuai dengan pendapat Pratama (2013), yang menyatakan bahwa bahan uji diambil dari udang dengan cara menggambil bagian organ pleopode, periopode, insang dan ekor dengan menggunakan gunting dan pinset. Sedangkan untuk sampel telur, naupli dan postlarva seluruh bagian tubuh digunakan sebagai bahan uji dengan cara disaring dengan saringan sesuai ukuran sampel kemudian dimasukan kedalam lepitan tissue dan direndam kedalam larutan alkohol 90 % selama 10 menit, setelah itu sampel dapat dilakukan tahap selanjutnya yaitu penggerusan. Penyaringan dan perendaman sampel dengan alkohol 90 % dapat dilihat pada Gambar 16.

Gambar 16. Penyaringan dan perendaman sampel.

Sumber : Data Primer (2014)

5.4. Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, tergantung dari acuan yang digunakan. Laboratorium Pengujian penyakit viral di PT.Suri Tani Pemuka (STP) Carita mengacu pada IQ 2000 sehingga metode ekstraksi DNA menggunakan CTAB DTAB Solution sebagai bahan untuk ekstraksi DNA, hal ini tidak sesuai dengan pendapat Babaja (2013), yang meyatakan bahwa proses ekstraksi tersebut menggunakan Lysis Buffer (IQ2000 TM). Hal ini dikarenakan proses ekstraksi menggunakan CTAB DTAB lebih bagus hasilnya sebab tahap pencucian yang dilakukan berulang kali, namun Lysis Buffer dan CTAB DTAB merupakan sama-sama prodak dari IQ 2000 TM. CTAB DATB (IQ2000 TM) dapat dilihat pada Gambar 17.

Gambar 17. CTAB DTAB Solution (IQ2000 TM)

Sumber : Data Primer (2014)

5.4.1. Pemotongan dan Penggerusan Sampel

Sebelum memulai proses ekstraksi, terlebih dahulu dilakukan persiapan alat seperti gunting dan pinset steril. Untuk menghindari kontaminasi terhadap sampel, maka gunting dan pinset yang akan digunakan sudah di Autoclav. Tahapan proses selanjutnya yang dilakukan ialah pemotongan (pengambilan) organ target untuk pengujian WSSV sampai berukuran kecil-kecil/halus dengan gunting dan pinset steril diatas aluminium foil yang sudah diberi lapisi kertas tissue. Proses pemotongan sampel dapat dilihat pada Gambar 18.

Gambar 18. Pemotongan Sampel

Sumber : Data Primer (2014)

Setiap sampel harus diproses dengan menggunakan tempat dan alat yang berbeda. Hal ini dilakukan untuk menghindari kontaminasi silang DNA/RNA virus. Selanjutnya setelah sampel dipotong-potong lalu dilakukan penghancuran dinding dan membran sel dengan menggunakan DTAB Solution yang dibarengi dengan penggerusan sampel didalam tube dengan mengunakan sumpit atau penggerus plastik, satu sampel dalam tube mengunakan sumpit atau penggerus plastik yang berbeda dengan ara sampel ditumbuk hingga halus supaya mendapatkan bagian terkecil pada organisme seperti sel sehingga lebih mudah mendapatkan DNA target saat ekstraksi. Proses pengerusan sampel dapat dilihat pada Gambar 19.

Gambar 19. Penggerusan sampel.

Sumber : Data Primer (2014)

Kemudian sisa sampel yang tidak digunakan untuk ekstraksi disimpan pada suhu -20⁰C. Sisa sampel yang tidak digunakan ini dibungkus dengan plastik dan diberi kode sampel serta tanggal pengujian. Hal ini dilakukan untuk verifikasi apabila terjadi kesalahan dalam pengujian. Proses penyimpanan sisa sampel uji dapat dilihat pada Gambar 20.

Gambar 20. Penyimpanan Sampel Uji dalam Freezer

Sumber : Data primer (2014)

5.4.2. Degradasi Protein.

Tahapan selanjutnya adalah degradasi protein, dimana pada tahap ini jaringan yang telah digerus dengan DTAB Solution kemudian dipanaskan atau diinkubasi pada 75 ⁰C agar protein dan lipid yang ada didalam sel dapat terurai selama 5 menit lalu didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit. Untuk proses inkubasi dapat dilihat pada Gambar 21.

Gambar 21. Proses Inkubasi

Sumber : Data Primer (2014)

Dalam melakukan degradasi protein, ada tahap isolasi tambahan yang mungkin diperlukan untuk sampel yang banyak mengandung protein, lemak, polisakarida atau material ekstraseluler seperti otot dan jaringan lemak. Setelah didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit kemudian dispin down selama 20 detik dalam mesin sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm.

Pelet mengandung membran ekstraseluler polisakarida dan DNA yang mempunyai berat molekul besar, sementara supernatan mengandung DNA. Pada sampel dari jaringan lemak, maka lemak yang terkumpul pada permukaan harus dihilangkan. Pada setiap proses isolasi DNA, larutan homogenat jernih dipindahkan ke dalam mikrotube baru dan dilanjutkan dengan penambahan chloroform serta fase separasi berikutnya.

5.4.3. Fase separasi

Tahapan dalam ekstraksi DNA selanjutnya adalah fase separasi. Fase ini dilakukan dengan cara inkubasi sampel yang telah dihomogenisasi selama 5 menit pada suhu 75 ^oC dan dilanjutkan dengan dispin down selama 10 detik dengan kecepatan 12000 rpm. Hal ini dilakukan agar proses disosiasi kompleks nukleoprotein berjalan sempurna. Kemudian langkah selanjutnya adalah penambahkan chloroform sebanyak 700 µl. Penambahan chloroform ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan materi lain atau untuk mengikat protein.

Tahapan selanjutnya adalah menutup mikrotube baru yang telah berisi supernatan DNA dan dikocok perlahan kemudian divortex selama 20 – 30 detik. Proses pemvortekan dapat dilihat pada Gambar 22.

Gambar 22. Proses Homogenisasi

Sumber : Data Primer (2014)

Berdasarkan Gambar 15 diatas hal ini bertujuan untuk menguraikan kotoran terlebih dahulu sebelum chlorofom mengikat protein. Tahapan selanjutnya adalah sentrifus sampel dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit.

Perlu diingat juga dalam penataan mikrotube dalam alat sentrifugasi harus dalam keadaan seimbang. Hal ini dilakukan agar sentrifugasi dapat bekerja secara sempurna. Proses sentrifusi DNA dapat dilihat pada Gambar 23.

Gambar 23. Proses Sentrifugasi DNA

Sumber : Data Primer (2014)

Setelah sentrifus, campuran sampel dalam mikrotube terpisah menjadi 3 bagian yaitu: bagian bawah berwarna merah (fase phenol-chloroform), interfase, dan bagian atas yang jernih (fase air). DNA terlarut dalam fase air. Adapun pemisahan fase separasi dapat dilihat pada Gambar 24.

Gambar 24. Hasil Pemisahan Fase Separasi

Sumber : Data Primer (2014)

5.4.4. Pencucian Supernatan

Setelah selesai melakukan sentrifus dalam fase separasi supernatan akan berada pada bagian atas dalam mikrotube, supernatan ini bagian yang diambil dengan menggunakan mikropipet sebanyak 200 µl dan dicuci dengan larutan CTAB Solution dan Aquadest yang telah dicampurkan dalam mikrotube baru. Komposisi larutan dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Komposisi larutan dalam pencucian supernatan DNA

No	Supernatan	CTAB Solution	Aquadest
1	200 µl	100 µl	900 µl

Sumber : Data Primer (2014).

Berdasarkan data Tabel 4 diatas, setelah supernatan dicampurkan kelarutan CTAB Solution dan Aquadest selanjutnya campurkan secara perlahan dengan cara dibolak-balik menggunakan tangan lalu diinkubasi selama 5 menit dalam suhu 75 ^oC kemudian didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit dan diteruskan dengan sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm.

5.4.5. Pengenceran Pelet

Setelah proses pencucian supernatan selesai yaitu setalah disentrifus sampel yang ada dalam tube akan menjadi dua bagian yaitu lapisan bagian atas adalah supernatan dan lapisan bagian bawah adalah pelet. Pada fase ini bagian yang akan digunakan untuk melanjutkan ke langkah selanjutnya adalah bagian lapisan bawah yaitu pelet, sehingga bagian lapisan atas atau supernatan dibuang secara berhati-hati agar pelet tidak ikut terbuang. Selanjutnya adalah pengenceran pelet dengan menggunakan Dissolving Solution sebanyak 150 µl tiap masing-masing tube, setelah itu campur perlahan agar pelet dengan Dissolving Solution dapat tercampur rata kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 75 ^oC lalu diamkan pada suhu ruang selama 5 menit dan diteruskan dengan proses setrifus selama 5 menit pada kecepatan 12.000 rpm.

5.4.6. Presipitasi DNA

Tahapan dalam ekstraksi DNA selanjutnya adalah presipitasi. Presipitasi ini merupakan suatu proses koagulasi atau penggumpalan DNA yang larut dalam fase air menjadi padat. Hal yang dilakukan dalam tahapan ini dengan cara memindahkan cairan lapisan paling atas (supernatan) ke dalam mikrotube baru yang sudah diberi kode sampel dan tanggal pengujian pada mikrotube yang berisi sampel.

Presipitasi DNA dari fase air (supernatan) dengan cara menambahkan ethanol 95 % dingin sebanyak 3.000 µl, campur perlahan lalu disentrifus dengan kecepatan tidak lebih dari 12.000 rmp selama 5 menit yang bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya DNA dicuci kembali dengan menggunakan ethanol 70 % dingin sebanyak 200 µl, campur perlahan lalu dispin dwon selama 10 detik dengan tujuan untuk menghilangkan kotoran yang dapat terikat pada laruta ethanol. Akhir dari proses presipitasi DNA ini DNA akan membentuk pelet seperti gel yang menempel pada dinding dan dasar tube.

5.4.7. Pengenceran DNA

Setelah dilakukan tahap presipitasi DNA dan didapatkan DNA yang berupa pelet seperti gel yang menempel pada dinding dan dasar tube lalu membuang larutan ethanol secara hati-hati, kemudian pelet dikering anginkan pada suhu ruang selama 30 menit diatas lembaran tissue dengan membuka tube dan meletakan tube pada posisi terbalik..

Dalam pengeringan DNA jangan membiarkan DNA menjadi kering benar karena akan menurunkan kelarutannya. Proses pengeringan pelet DNA dapat dilihat pada Gambar 25.

Gambar 25. Pengeringan Pelet DNA

Sumber : Data Primer (2014)

Setelah pelet kering tahapan selanjutnya yaitu melarutkan sampel DNA dengan menggunakan DEPC ddH₂O atau TAE Buffer sesuai dengan ukuran pelet, banyak sedikitnya pelet yang dihasilkan sesuai dengan stadia udang yang diuji sehingga untuk sampel stadia PL dan organ bagian induk diberi DEPC ddH₂O sebanyak 120 – 305 µl sedangkan untuk sampel stadia naupli diberi DEPC ddH₂O sebanyak 40 – 50 µl. Setelah itu sampel divortex selama 30 detik dan disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Kemudian sampel siap untuk diamplifikasi atau disimpan terlebih dahulu dalam freezer dengan suhu -20^oC. Adapun klasifikasi pelet dan dosis pemberian DEPC ddH₂O dapat dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5. Dosis pemberian DEPC ddH₂O sesuai dengan ukuran pelet.

No	Jenis sampel	Klasifikasi pelet	Ukuran pelet	Dosis DEPC ddH₂O
1	Induk	Tidak ada	-	40 µl
		Kecil	± p x l = 1mm x 1mm	50 – 60 µl
		Sedang	± p x l = 1,5mm x 1,5mm	60 – 80 µl
		Besar	± p x l = 2mm x 1,5mm	90 – 100 µl
2	Naupli	Tidak ada	-	30 µl
		Kecil	± p x l = 1mm x 1mm	40 µl
		Sedang	± p x l = 1,5mm x 1mm	50 µl
		Besar	± p x l = 2mm x 1,5mm	50 – 60 µl
3	PL dan mysis	Tidak ada	-	40 µl
		Kecil	± p x l = 1mm x 1mm	50 – 60 µl
		Sedang	± p x l =1,5mm x 1,5mm	70 – 80 µl
		Besar	± p x l = 3mm x 2mm	70 – 80 µl

Sumber : Data Primer (2014).

5.5. Amplifikasi DNA

Setelah sampel selesai diektraksi langkah selanjutnya adalah tahapan Amplifikasi DNA, pada tahap amplifikasi merupakan tahap pengkopian DNA melalui beberapa tahap secara berulang-ulang sehingga dapat dideteksi dengan elektroforesis. Amplifikasi dapat dibantu dengan menggunakan alat thermal cycler atau yang lebih dikenal dengan ‘’PCR machin’’, alat ini hanya semacam inkubator yang mampu mengatur mengubah suhu dengan sangat cepat sesuai dengan settingnya. Pada tahap amplifikasi dilakukan dua kali proses amplifikasi yaitu First PCR dan Nested PCR.

5.5.1. First PCR

Dalam suatu proses amplifikasi thermal cycler atau PCR machine sendiri tidak dapat melakukan proses pelipatgandaan DNA target tanpa ada bantuan enzym polymerase, pada tahap first PCR atau running I pada DNA meneruskan sequen yang terbentuk sehingga menjadi bebrapa sequen DNA yang akan dihasilkan, kemudian akan diteruskan dengan proses denaturasi, annealing, dan extention. Berikut komposisi pembuatan MIX First PCR untuk virus WSSV dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Komposisi pembuatan MIX First PCR untuk virus WSSV.

Komponen Reagen	Volume/reaksi (µl)	Volume n-reaksi
Premix First	7,5	N x 7,5
Taq DNA Polymerase	0,5	N x 0,5
Template DNA	2,0
Note : Jumlah reaksi : jumlah sampel + 1 kontrol (+) dan 1 kontrol (-)/NTC.

Sumber : Data Primer (2014).

Berdasarkan data Tabel 6 diatas setelah bahan siap kemudian campurkan Premix First 7,5 µl kalikan jumlah sampel dengan Taq DNA Polymerase 0,5 µl kalikan jumlah sampel kedalam tabung eppendorf. Setelah dicampurkan kemudian divortex selama 10 detik kemudian dispin down selama 10 detik dengan kecepatan 12.000 rpm didalam mesin sentrifuge agar bahan-bahan dapat tercampur rata. Langkah selanjutya adalah menyiapakan mikrotube sebanyak sampel dan ditambah dua mikrotube untuk kontrol positif dan kontrol negatif, kemudian ambil reagent MIX First PCR sebanyak 8 µl dari dalam tabung eppendorf kedalam masing-masing mikrotube lalu tambahkan 2 µl template DNA termasuk kontrol positif dan kontrol negatif (NTC). Pembuatan reagent MIX First PCR dapat dilihat pada Gambar 26.

Gambar 26. Pembuatan Reagent MIX First PCR

Sumber : Data Primer (2014)

Setelah template dimasukan kedalam reagent MIX PCR sebanyak 2 µl sampel siap untuk diamplifikasi, sebelum diamplifikasi hendaknya sampel dalam mikrotube disentuh-sentuh dengan jari tangan agar tidak terdapat gelembung pada mikrotube yang akan menyebabkan proses kinerja pada mesin amplifikasi tidak sempurna sehingga harus benar-benar diperhatikan. Setelah itu baru sampel siap untuk dimasukan kedalam mesin amplifikasi dan dilakukan running tahap pertama, didalam mesin amplifikasi (Thermal Cycler 2720) mesin akan bekerja sesuai program yang telah ditentukan. Proses running tahap pertama dapat dilihat pada Gambar 27.

Gambar 27. Proses Running I

Sumber : Data Primer (2014)

Pada proses running I memiliki pengaturan mesin amplifikasi yang berbeda dengan proses running ke II, hal ini dikarenakan tujuan dan sasaran running yang berbeda pada setiap tahap amplifikasi. Adapun pengaturan waktu dan suhu pada proses running I dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7. Pengaturan suhu dan waktu pada proses amplifikasi I.

Step Suhu (^oC)	Waktu	Siklus
94	02.00	5
94	00.20
62	00.20
72	00.30
94	00.15	15
62	00.15
72	00.20
72	00.30	Hold
20	0.30
4	∞

Sumber : Data Primer (2014)

5.5.2. Nested PCR

Nested PCR merupakan proses amplifikasi yang dilakukan pada tahap kedua atau disebut dengan running I, Dalam reaksi Nested PCR untuk deteksi virus WSSV pada udang vannamei yang dilakukan di Laboratorium Pengujian penyakit viral di PT.Suri Tani Pemuka (STP) Carita yaitu dengan pembuatan master mix terlebih dahulu. Adapun komposisi pembuatan MIX second run virus WSSV dapat dilihat pada Tabel 8.

Tabel 8. Komposisi Pembuatan MIX Second Run untuk virus WSSV.

Komponen Reagen	Volume/reaksi (µl)	Volume n-reaksi
Premix Nested	14	N x 14
Enzyme Taq Polymerase	1	N x 1
DNA hasil amplifikasi I	10
Note : Jumlah reaksi : jumlah sampel + 1 kontrol (+) dan 1 kontrol (-)/NTC.

Sumber : Data Primer (2014)

Setelah semua bahan dicampur kedalam tabung eppendorf 1,5 ml kemudian di spin down MIX agar tercampur rata. Selanjutnya baru ditambahkan sampel DNA hasil amplifikasi I sebanyak 10 µl, termasuk kontrol negatif dan kontrol positif.

Kontrol positif sebagai penentu positif tidaknya sampel yang diuji diperoleh dari sampel sebelumnya yang sudah positif terserang WSSV. Sedangkan kontrol negatif sebagai penentu keberhasilan PCR dengan tidak terjadinya kontaminasi, selanjutnya sampel DNA dan kontrol yang telah homogen dimasukkan ke dalam mesin PCR atau thermal cycler dan diatur sesuai dengan pengujian yang akan dilakukan karena masing-masing virus memiliki syarat amplifikasi pengaturan suhu yang berbeda-beda. Pengaturan suhu pada alat thermal cycler PCR untuk WSSV dapat dilihat pada Tabel 9.

Tabel 9. Pengaturan Suhu dan Waktu Amplifika II

Step Suhu (^oC)	Waktu	Siklus
94	00.20	30
62	00.20
72	00.30
72	00.30	Hold
20	0.30
4	∞

Sumber : Data Primer (2014)

Proses yang terjadi pada running I sama dengan proses runnining II dimana keduanya akan mengalami proses denaturasi, annealing, dan extention. Alat PCR memiliki prinsip memecah rantai ganda (double-stranded) menjadi rantai tunggal (single-stranded). Pemecahan rantai ganda menjadi tunggal memerlukan waktu 20 detik dan suhu tinggi 94 ºC proses ini disebut juga dengan denaturasi. Apabila DNA target mengandung banyak nukleotida G/C suhu denaturasi dapat ditingkatkan. Denaturasi ini merupakan proses yang penting dimana jika proses ini tidak lengkap kurang dari 20 detik akan menyebabkan renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mempengaruhi kerja enzim taq polymerase dan mempengaruhi keberhasilan proses PCR.

Penurunan suhu (annealing) merupakan pelekatan primer pada DNA untai tunggal pada suhu 62 ºC. Primer akan menempel pada pangkal (forward) dan ujung (reverse) masing-masing DNA tunggal, dengan suhu yang tepat maka akan mengurangi kesalahan penempelan primer pada ujung 5’ dan 3’. Setelah proses penempelan primer selesai, maka diteruskan dengan extention atau pemanjangan primer yang telah menempel pada template suhu 72 ºC dengan bantuan enzyme polymerase (Taq polymerase). Lama proses extention ditentukan oleh panjangnya DNA target yang akan dilipatgandakan dengan suhu yang digunakan karena Taq polymerase tahan panas sampai suhu 100 ºC.

Proses penempelan primer (annealing) merupakan penempelan primer pada DNA yang telah terbelah pada tempat yang spesifik. Bila suhunya dinaikan lagi sampai 72 ⁰C, maka primer dengan bantuan enzim DNA polymerase akan membentuk untaian DNA sesuai dengan runutan DNA yang terbelah proses ini disebut elongasi (extention).

Proses denaturation, annealing dan extention akan terjadi pada siklus yang berulang 30 kali. Pada akhir reaksi akan terbentuk 2ⁿ DNA untai ganda, dimana n adalah jumlah ulangan siklus sekitar 10⁶- 10⁹ kali dari jumlah DNA target awal. Extra extention pada suhu 72 ºC selama 30 menit untuk memberi kesempatan enzyme polymerase yang belum menyelesaikan reaksinya sehingga tidak ada sintesa DNA baru yang belum selesai. Setelah proses amplifikasi selesai, sampel dapat disimpan dengan pengaturan suhu -20 ⁰C atau dapat juga langsung digunakan untuk proses elektroforesis.

5.6. Elektroforesis

Produk hasil amplifikasi mengandung potongan DNA yang panjangnya tergantung dari jenis primer yang dipakai. Oligonukleotida primer merupakan fragmen nukleotida yang komplemen dengan ujung-ujung DNA yang akan dilipatgandakan, terdiri dari primer forward dan reverse. Sepasang primer ini berfungsi untuk mengenali daerah awal dan akhir target DNA pada masing-masing kit yang dikemas dalam satu mikrotube.

DNA hasil amplifikasi ini belum bisa dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena itu produk PCR ini perlu dianalisa lebih lanjut dengan elektroforesis dan pewarnaan gel dengan larutan Ethibium Bromide (EtBr), selanjutnya dibaca dengan sinar UV dalam UV-Transilluminator.

Elektroforesis pada prinsipnya merupakan perpindahan molekul yang bermuatan listrik negatif bergerak ke kutub positif. Hal ini sesuai dengan pendapat Klug & Cumming (1994), yang menyatakan bahwa elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode).

Proses elektroforesis yang dilakukan di PT. STP Carita dengan cara dan prosedur sebagai berikut :

1. Pastikan volume buffer TAE 1X merendam seluruh permukaan gel.

2. Buat titik-titik loading dye pada sebuah kertas almunium foil dengan jumlah sesuai reaksi.

3. Pipet 8 µl produk PCR, lalu aduk kedalm loading dye dengan menggunakan pipet hingga rata.

4. Masukkan campuran produk PCR dengan loading dye ke dalam well/sumur gel sesuai urutan sampel, dengan meletakkan negatif sampel sebuah positif sampel menghindari kontaminasi.

5. Masukkan DNA weight marker pada posisi tengah gel lalu diikuti kontrol positif.

6. Hidupkan power supplay, dengan waktu 8 – 10 menit (maksimum voltase 100 volt), elektroforesis mulai.

Sedangkan untuk alat yang digunakan untuk proses elektroforesis di PT.STP Carita dapat dilihat pada Gambar 28.

Gambar 28. Alat Elektroforesis

Sumber : Data Primer (2014)

Tegangan listrik yang digunakan 100 volt dengan waktu 10 menit. Dengan adanya arus listrik ini, membuat molekul DNA bermigrasi dari kutub positif ke kutub negatif sesuai dengan ukuran pasangan basanya.

5.6.1. Pembuatan Buffer TAE (Tris Acetate EDTA)

Pembuatan Buffer TAE 1X dari TAE 40X, buffer ini akan digunakan utuk media perendaman gel agarose saat proses elektroforesis sebagai penghantar arus listrik. Pembuatan TAE buffer dilakuakn dengan tahapan sebagai berikut :

1. Msukkan 975 ml aqudest ke dalam botol duran dengan menggunakan gelas ukur 1.000 ml.

2. Tambahkan 25 ml buffer TAE 1X ke dalam botol duran dengan menggunakan gelas ukur 50 ml, lalu kocok hingga larut tercampur sempurna.

3. Larutan siap untuk digunakan.

4. Catatan penggunaan bahan ke dalam form stok bahan.

5.6.2. Pembuatan Ethibium Bromide

Ethibium Bromide (EtBr) merupakan bahan yang digunakan untuk memvisualisasi potongan-potongan DNA selama proses elektroforesis. Hal ini sesuai dengan pendapat Sulandari dkk (2003) yang menyatakan bahwa Etidium merupakan sebuah molekul yang dapat mengikat kuat pada DNA. Etidium juga biasa digunakan dalam biokimia untuk memvisualisasi potong-potongan DNA yang telah dipisahkan pada gel elektroforesis. .

Untuk pembuatan larutan EtBr dapat dibuat dengan cara menambahkan 25 µl EtBr dalam 500 ml Buffer TAE kedalam botol duren kemudian kocok hingga larut dan homogen. Larutan siap untuk digunakan.

5.6.3. Pembuatan gel agarose

Gel agarose merupakan suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang dibuat dengan melarutkan suatu bahan agarose tersebut ke dalam larutan buffer. Di Laboratorium Pengujian penyakit viral di PT.Suri Tani Pemuka (STP) Carita yang digunakan adalah gel agarose 2 % yang dibuat dengan cara memasukkan 2 gram agarose dalam 100 ml larutan Tris Acetat EDTA (TAE), kemudian dipanaskan dengan hot plant sampai larutan dan mendidih. Hal ini sesuai dengan pendapat Sulandari dkk (2003), Gel agarose dibuat dengan melarutkan suatu bahan agarose dengan melarutkannya dalam suatu buffer lalu dipanaskan dengan oven gelombang mikro (microwave oven). Untuk proses pembuatan gel agaros dapat dilihat pada Gambar 29.

Gambar 29. Pembuatan Agarose

Sumber : Data Primer (2014)

Setelah larutan dan mendidih, didiamkan sampai dingin sampai suhunya turun sekitar 50 – 70 ºC. Kemudian dituangkan dalam cetakan gel yang sudah disiapkan. Gel agarose ini dicetak dalam tray dengan pencetak sumur (sisir) yang disesuaikan dengan jumlah sampel yang diuji. Hal yang perlu diperhatikan saat menuangkan gel agarose ialah menghindari adanya gelembung pada gel. Hal ini sesuai dengan pendapat Sulandari dkk (2003), yang menyatakan bahwa setelah dipanaskan agarose didinginkan hingga suhunya mencapai 60 ºC, kemudian baru dituangkan dalam cetakan gel. Pencetakan gel agaros dapat dilihat pada Gambar 30.

Gambar 30. Proses pencetakan gel agaros

Sumber : Data Primer (2014)

Untuk cetakan kecil yang berisi 8 sampel dituangkan 12,5 ml gel agarose cair. Sedangkan untuk cetakan besar (17 sampel) dituangkan 25 ml gel agarose cair. Kemudian dibiarkan dingin selama 30 menit dan gel siap digunakan.

5.7. Staining (Pewarnaan) DNA

Perpendaran pita - pita DNA akan diamati dalam UV Transilluminator dan penentuan ukuran fragmen dilakukan dengan cara membandingkan mobilitas atau kecepatan pergerakan fragmen dengan DNA standar yang telah diketahui dalam kontrol positifnya. Visualisasi DNA lebih mudah menggunakan bahan kimia yang dapat berpendar pada sinar terutama sinar UV. Oleh karena itu bahan kimia yang dipakai ialah Etidium Bromida (EtBr). Hal ini sesuai dengan pendapat Sulandari dkk (2003), yang menyatakan bahwa Pewarnaan DNA dengan larutan Et Br ini akan memudahkan kita untuk dapat melihat hasilnya karena biasanya dalam proses ini Et Br dapat memvisualisasikan potongan DNA setelah melalui proses elektroforesis.

Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan dengan pewarnaan (staining) dengan ethidium bromide (EtBr). EtBr ini bersifat karsinogenik sehingga saat dilakukan pewarnaan diharuskan dilengkapi dengan sarung tangan. Pewarnaan dilakukan dengan perendaman dalam larutan EtBr selama 15 menit.

Ethidium bromide akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna orange fluoresance yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet. Larutan ethidium bromida mengikat DNA plasmid, sehingga ketika larutan ini bereaksi dengan plasmid dan diletakkan dalam ruang UV akan menyebabkan berpendarnya ethidium bromida dalam gel. Berpendarnya senyawa ini dapat menjadi indikator pergerakan DNA dalam gel. Proses staining dapat dilihat pada Gambar 31.

Gamabar 31. Proses Staining

Sumber : Data Primer (2014)

5.8. Destaining (Perendaman) Gel Agarose

Untuk menghilangkan kandungan background EtBr yang masih tersisa pada gel agarose, maka dilakukan perendaman gel agarose tersebut pada aquades steril selama 5 menit. Tahapan proses destaining gel agarose dapat dilihat pada prosedur dibawah ini :

1. Gunakan sarung tangan bebas serbuk anti lengket.

2. Lapisi dengan sarung tangan karet tebal.

3. Gunakan masker dan google.

4. Masukkan gel agarose ke dalam nampan yang telah berisi larutan aquadest.

5. Rendam selama 5 menit.

6. Angkat gel dari larutan dengan menggunakan alat peniris

7. Gel siap untuk diletakkan set eluminator.

5.9. Pembacaan Hasil dan Dokumentasi

Pembacaan hasil pengujian WSSV dilakukan dengan meletakkan gel agarose hasil elektroforesis di atas UV-Transsilluminator. Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet oleh UV-Transsilluminator akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel, satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. UV Transilluminator dapat dilihat pada Gambar 32.

Gambar 32. UV Transilluminator

Sumber : Data Primer (2013)

Penanda (marker) yang merupakan campuran Loading Dye dan DNA marker 848 bp, 630 bp, 333 bp. dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Dokumentasi hasil produk PCR menggunakan kamera digital. Hasil uji PCR untuk pengujian virus WSSV selama Kerja Praktek Akhir di Laboratorium Pengujian penyakit viral di PT.Suri Tani Pemuka (STP) Carita dapat dilihat pada Tabel 10.

Tabel 10. Laporan Hasil Uji WSSV di Laboratorium pengujian penyakit viral di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Carita.

No	Tanggal Pengujian	Asal Sampel	Jumlah Sampel	Hasil Uji
1.	28 Maret 2014	PT. STP Indramayu	10	Negatif
2.	7 April 2014	PT. STP Anyer	12	Negatif
3.	10 April 2014	PT. STP Anyer	10	Negatif
4. 5.	14 April 2014 22 April 2014	PT. STP Carita PT. STP Carita	10 10	Negatif Negatif
6	28 April 2014	PT. STP Indramayu	12	Negatif

Sumber : Data Primer (2014)

Pembacaan hasil uji virus WSSV selama Kerja Praktek Akhir yang dilakukan di Laboratorium pengujian penyakit viral di PT. Suri Tani Pemuka (STP) Carita dapat dilihat pada Lampiran 4.

6.0. Penanganan Limbah Uji PCR

Dari hasil pengujian laboratorium terutama pengujian virus dengan menggunakan PCR, limbah yang dihasilkan sangat berbahaya dan tidak ramah lingkungan. Misalnya: limbah sisa larutan ethibium bromide yang bersifat karsiogenik dapat memicu terjadinya kanker. Oleh karena itu diperlukan penanganan limbah yang benar agar hasil samping pengujian tidak membahayakan bagi lingkungan.

Peralatan yang didaur ulang atau yang akan digunakan kembali seperti cawan petri, gunting, pinset dan penggerus dilakukan penangan dengan cara perendaman dengan larutan kaporit sebanyak 1000 ppm selama 24 jam, setelah itu dicuci dengan diterjen dan dibilas dengan air tawar sampai bersih.

Limbah padat hasil PCR yang dihasilkan antara lain: gel agarose hasil elektroforesis, mikrotip, mikrotube, tissue dan sarung tangan habis pakai juga harus dikelola dengan baik agar tidak mencemari lingkungan. Limbah padat tersebut dibungkus dalam plastik dan dibuang pada tempat sampah yang berbeda untuk menghindari adanya pencemaran. semua limbah padat seperti gel agarose setelah digunakan dikumpulkan dalam satu wadah plastik dan dibakar kemudian dikubur agar bekas pewarnaan tidak mencemari lingkungan sedangkan mikrotip dan mikrotube dikumpulkan dalam satu wadah kemudian dibakar.

6. KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil Kerja Praktek Akhir di Laboratorium uji kesehatan udang PT. Suri Tani Pemuka (STP) Carita dapat diperoleh kesimpulan sebagai berikut :

1. Tahapan proses identifikasi virus di Laboratorium uji kesehatan udang PT. Suri Tani Pemuka (STP) Carita meliputi: preparasi, ekstraksi, amplifikasi, elektroforesis, pembacaan hasil dan dokumentasi.

2. Ekstraksi DNA yang dilakukan di Laboratorium uji kesehatan udang PT. Suri Tani Pemuka (STP) Carita dengan menggunakan CTAB DTAB Solution IQ2000 TM. Selama proses ekstraksi ini melalui beberapa tahapan yaitu: penggerusan sampel, degradasi protein, separasi, pencucian supernatan, pengenceran pelet, presipitasi DNA dan pengenceran DNA sebelum dilakukan amplifikasi.

3. Bahan yang digunakan untuk amplifikasi adalah kit IQ 2000^TM.

4. Proses elektroforesis, dilakukan dengan meletakkan sampel diatas gel agarose pada alat elektroforesis, selanjutnya gel agarose diletakkan pada larutan ethibium bromide. Karena ethibium bromide bersifat karsiogenik maka selama melakukan elektroforesis harus menggunakan sarung tangan.

5. Pembacaan hasil uji virus yang dilakukan di Laboratorium uji kesehatan udang PT. Suri Tani Pemuka (STP) Carita hanya sampai pembacaan secara kualitatif, sampel tersebut terserang WSSV atau negatif terserang WSSV.

6.2. Saran

Dari Kerja Praktek Akhir ini yang dapat disarankan antara lain:

1. Sebaiknya menggunakan masker ataupun jas laboratorium selama melakukan proses PCR agar keselamatan kerja atau human safety analis terjamin. Selain itu, menghindari kemungkinan adanya kontaminasi silang terhadap sampel yang akan dilakukan untuk proses PCR.

2. Sebaiknya dilakukan penambahan analis laboratorium untuk meningkatkan kinerja Laboratorium uji kesehatan udang PT. Suri Tani Pemuka (STP) Carita..

3. Sebaiknya dilakukan penanganan limbah hasil uji dengan baik agar tidak mencemari lingkungan. Seperti gel agarose bekas PCR harus dibungkus dengan plastikdan dibuang pada tempat sampah tersendiri agar lingkungan sekitar tidak terkontaminasi.

Adeede88

Selasa, 02 Juni 2015

LAPORAN TEKNIK IDENTIVIKASI PENYAKIT WSSV PADA UDANG VANNAMEI DENGAN METODE PCR

Tidak ada komentar:

Posting Komentar

Mengenai Saya